Hyperandrogénny model myši na štúdium protokolu syndrómu polycystických vaječníkov (preložené do nemčiny)

Zhrnutie

Popisujeme vývoj modelu chudej myši podobnej PCOS pomocou peliet dihydrotestosterónu na štúdium patofyziológie PCOS a potomstva týchto matiek podobných PCOS.

Abstrakt

Hyperandrogenémia hrá rozhodujúcu úlohu v reprodukčnej a metabolickej funkcii u žien a je charakteristickým znakom syndrómu polycystických vaječníkov. Vývoj tenkého modelu myši podobného PCOS, ktorý napodobňuje ženy s PCOS, je klinicky relevantný. V tomto protokole popisujeme takýto model. Vložením dĺžky DHT (dihydrotestosterónu) peliet z kryštalického prášku 4 mm (celková dĺžka peliet je 8 mm) a ich výmenou mesačne môžeme použiť model myši podobný PCOS so sérovou hladinou DHT dvakrát vyššou ako u myší, ktoré neboli implantované Na výrobu DHT (nie DHT). Pozorovali sme reprodukčnú a metabolickú dysfunkciu bez zmeny hmotnosti alebo zloženia tela. Aj keď sa prejavuje vysoká úroveň neplodnosti, malá podskupina týchto samíc myší podobných PCOS môže otehotnieť a ich potomstvo vykazuje u dospelých oneskorenú pubertu a zvýšené hladiny testosterónu. Tento tenký model myši podobný PCOS je užitočným nástrojom na štúdium patofyziológie PCOS a potomstva týchto matiek podobných PCOS.

Úvod

Táto nová paradigma (relevantné pre spoločnosť podľa kritérií NIH a AE-PCOS) modeluje toto ochorenie tak, že produkuje relatívne podobné hladiny androgénov ako ženy s PCOS 2–3-krát vyššou hladinou testosterónu alebo DHT v porovnaní so ženami, ktoré neboli ovplyvnené. Avšak tento model je udržiavaný konštantnou exogénnou DHT a nie programovaným endogénnym hyperandrogenizmom, akonáhle je DHT stiahnutá. Celkovým cieľom tohto článku je zamerať sa na 1) ako peletovať DHT; (2) ako vygenerovať model myši typu Lean PCOS; (3) Stratégie na hodnotenie potomkov samíc z týchto matiek. Ostatné merania a vyhodnotenie fenotypov nie sú predmetom tohto rukopisu, ale sú uvedené v 5, 15, 23, 24, 25, 26.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Tu uvádzame podrobné protokoly na prípravu a zabudovanie peliet DHT „a“ na reprodukčné a metabolické testovanie. Myši použité v tejto štúdii mali zmiešané pozadie (C57/B6, CD1, 129Sv) a bola im poskytnutá starostlivosť s jedlom a vodou ad libitum v 14/10 hodinovom cykle svetlo-tma pri 24 ° C na Broadwayi Budova pre výskum výskumných zariadení na lekárskej fakulte Univerzity Johns Hopkins University. Všetky postupy boli schválené Výborom pre starostlivosť a použitie zvierat na Univerzite Johns Hopkins.

1. Vytvorte model myši podobný PCOS

2. Posúďte reprodukčné profily samíc potomkov z chronicky vložených matiek DHT

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Sérová hladina DHT a test tolerancie glukózy

Hladiny DHT sa merali zo odobratého séra metódou ELISA aj LC-MS pomocou protokolu 1.24 - 1.25 a 2.9, 3.0. Absolútne hodnoty DHT sa líšia medzi hmotnostnou spektrometriou a ELISA, avšak relatívny násobok inzertu DHT oproti inzertu bez DHT je podobný z obidvoch testov a z experimentov 15, 23, 24 ((približne 2-násobok) Obrázok 2A). Hladiny DHT sú významne zvýšené u myší DHT a bez DHT v dôsledku predsudkov v dôsledku tehotenstva, ale hladiny DHT sú u myší DHT dvojnásobne vyššie v porovnaní s myšami bez DHT v obidvoch gestách (jeden deň pred párením) ) a gestačný vek (približne 14 dní) -krát (obr. 2 b). Pretože ELISA a LC-MS rozlišujú absolútne hladiny DHT, počítame v rámci testov relatívne hladiny (násobná zmena: hladina DHT so zavedením DHT oproti inzercii bez DHT). Samice myší s DHT vykazovali zníženú toleranciu glukózy v porovnaní s ne-DHT 2 týždne po zavedení DHT podľa protokolu 1.23 (obrázok 3)).

Hmotnosť a puberta potomstva žien

Aj keď sú väčšinou sterilné, niektoré matky sú gravidné a majú šteniatka (gravidita je asi 30%, takže matky z plodnosti dostaneme z 10 testov, zvyčajne z 3 gravidných), pozri protokol 2.1). Môžeme teda vyhodnotiť chronické androgénne účinky u samíc na potomstvo samíc. Ženské potomky matiek vložených do DHT sa nazývajú dcéry DHT a potomkov samíc vložených do DHT sa nazývajú dcéry DHT. Nepozorovali sme žiadny rozdiel medzi dcérami bez DHT a DHT vo veku vaginálneho otvorenia. Prvý estrus pre dcéry DHT je však značne oneskorený (35. deň pre dcéru bez DHT; 42. deň pre dcéru DHT). Je to spojené so zníženou telesnou hmotnosťou u 35 a 42 PND u dcér DHT v porovnaní s dcérami bez DHT (obrázok 4); pozri protokol 2.4 - 2.7).

Hladiny hormónov a estrálna cyklickosť u samíc potomkov

Hladiny testosterónu sa nemenia za 21 PND, ale znižujú sa za 26PND. Testosterón sa však zvyšuje pri 70 PND (obrázok 5, pozri protokol 2.9 - 3.0). Dospelé dcéry DHT vykazovali narušenú estrálnu cyklickosť v porovnaní s dospelými dcérami bez DHT, signifikantne dlhšie časy m/d a kratší čas v P a E (obr. 6A), B.; podľa metódy v protokole 1.17 - 1.22).

model
Obrázok 1: Identifikácia myši. V klietke je ucho myši zobrazené ako dierované na inej pozícii čísla myši. Myš č. 1 až 3 je vyrazená na pravom uchu a č. 4 až 6 je označená na ľavom uchu pri pohľade dorzálne. Ak je myš udieraná do uší na mieste č. 1 a č. 4, je to č. 7; na 2 a 5 je # 8; na 3 a 6 je # 9; v strede ľavého ucha je # 10; v polohe 1 až 10 je # 11; atď. Pre väčšiu verziu tohto obrázka kliknite sem.

myši
Obrázok 2: Sérové ​​hladiny DHT. Sérové ​​hladiny DHT. (A.) Sérové ​​hladiny DHT je možné merať pomocou ELISA a hmotnostnej spektrometrie. Aj keď sú absolútne hodnoty odlišné, dvojité testy preukázali podobné rozdiely medzi DHT a myšami neošetrenými DHT. (B.) Zmena zloženia DHT v sére v porovnaní s hladinami, ktoré nie sú DHT, v predsudkoch a gestačných časových bodoch. No-DHT (prázdne pruhy) a DHT implantované (čierne pruhy) samiciam myší pred (jeden deň pred párením) a počas tehotenstva (asi 14 dní tehotenstva). Hodnoty sú priemerné ± S.E.M. N = 5-8 na skupinu. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

protokolu
Obrázok 3: Test tolerancie glukózy (GTT). Myši s implantovaným No-DHT a DHT sa nechali hladovať cez noc a intraperitoneálne sa injikovala glukóza (2 g/kg BW) a v rôznych časových bodoch sa merala hladina cukru v krvi pre chvost. Myši ošetrené DHT vykazovali signifikantne zvýšené hladiny cukru v krvi medzi 30 až 120 minútami v porovnaní s myšami neošetrenými DHT. Hodnoty sú priemerné ± S.E.M. N = 4 až 12 na skupinu. * Zmenené P 2, kliknite sem, aby ste videli väčšiu verziu tohto obrázku.

protokolu
Obrázok 6: Chronický prebytok androgénu u matky vedie k narušenej cyklickosti u dospelých dcér. (A.) Znázornenie estrálnej cyklickosti ženského potomka. (B.) Percento času stráveného v každej estrálnej fáze (os Y) do 15 dní (os X) merané cytologickým vyšetrením vaginálnych buniek. Hodnoty sú priemerné ± S.E.M. N = 5-9 na skupinu. Štádium estrálneho cyklu (os Y). M/d: splnené/Diestrus; P: Proestrus; E: Teplo. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

protokolu
Tabuľka 1: Koktejl s obsahom ketamínu/xylazínu.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Hyperandrogenizmus je kľúčovou charakteristikou PCOS. Sérové ​​hladiny DHT (dvojnásobne vyššie u myší DHT ako u myší bez DHT) použité v tomto protokole sú nižšie ako hladiny hlásené inými výskumníkmi v predchádzajúcich štúdiách a sú kalibrované na proporcionálne napodobnenie žien pomocou PCOS 5, 19, 20, 21. Na rozdiel od iných modelov tento 2-násobný model DHT nemení telesnú hmotnosť a zloženie celého tela v porovnaní s myšami bez DHT do 3,5 mesiaca po zavedení DHT 23, 24. Tieto dospelé myši implantované do DHT sa udržiavajú konštantným exogénnym DHT. Aj keď sa zloženie celého tela nemení, u štíhlych žien s PCOS sa pozorovala zmena štruktúry a funkcie adipocytov 20. Je zaručené starostlivé preskúmanie rôznych skladov. Pozorovali sme narušenú estrálnu cyklicitu do jedného týždňa od zavedenia DHT 15 a znížili sme plodnosť počas trojmesačného hodnotenia plodnosti 23.

Malá podskupina samíc myší liečených DHT, ktorá mohla otehotnieť a mala potomstvo, poskytla príležitosť na vyhodnotenie účinkov preandestačnej, gestačnej a ošetrovateľskej hyperandrogenémie na vývoj plodu. Na získanie správne kontrolovaného experimentu je potrebných viac chovných sučiek, čo si vyžaduje vytvorenie najmenej 10 páriacich párov. Dcéry DHT sú vystavené DHT iba počas tehotenstva a pred 21 PNA. Dcéry DHT vykazovali nižšiu telesnú hmotnosť v porovnaní s dcérami bez DHT, čo naznačuje, že obezita alebo nadváha neboli žiadnymi mätúcimi premennými v pozorovaných fyziologických účinkoch 15 .

V počiatočných štúdiách sme validovali sérové ​​hladiny DHT v priebehu času. Nezistili sme žiadne významné rozdiely v sérovej DHT v 1., 2., 3. a 4. týždni 23., 24. dňa. Hladiny DHT poklesli po 4 týždňoch, takže pelety DHT vymieňame každé 4 týždne. Nepozorovali sme znížené účinky DHT, ktoré sme tiež skladovali 3 mesiace pri izbovej teplote. Pred vložením je dôležité pelety inkubovať vo fyziologickom roztoku 24 hodín. Tento krok je dôležitý pre rovnomerné uvoľnenie DHT z pelety (DHT sa uvoľňuje pomaly cez silastické trubice). Estrálnu cyklickosť je možné skontrolovať po 3 dňoch od zavedenia DHT a pošvový ster je možné vyšetriť aj priamo vo fyziologickom roztoku bez použitia chemikálií a farbiť sa pod svetelným mikroskopom po oboznámení sa s bunkami. 27 typov.

Metabolický fenotyp je možné hodnotiť po alebo po 2 týždňoch (14 dňoch) od zavedenia DHT. Účinky DHT na metabolizmus na konci štvrtého týždňa (28 dní) sú však mierne oslabené, aj keď nie je pozorovaný žiadny útlm pre reprodukčnú dysfunkciu. Preto zvyčajne hodnotíme metabolické funkcie na konci 2, 3, 5, 6, 7 týždňov (inzert 14, celkovo 21, 35, 42 a 49 dní 2-krát). Laboratórna výroba steroidných peliet s pomalým uvoľňovaním je vyspelá technika, ktorú si rôzne laboratóriá osvojili 33,34. Predstavuje lacnú alternatívu ku komerčným produktom, ktorých cena je vyššia ako 50 dolárov za peletu (90 dní DHT pelety ako 5 mg/peleta, IRA, NA-161). Výhodou komerčného produktu je, že nemusí byť vymenený do 90 dní, zatiaľ čo pelety opísané v tejto správe sa musia meniť každých 28 dní. Pre rozsiahle štúdie môže výskumníkom pripadať ekonomickejšie vyrábať vlastné pelety aj pri prácach potrebných na ich výmenu každé 4 týždne.

Ako pozorovali iní, modely s chronickou popôrodnou implantáciou DHT nevykazujú zvýšenú frekvenciu pulzovania LH, čo môže naznačovať rôzne patologické mechanizmy zvýšenej reprodukčnej funkcie indukovanej androgénom medzi vývojovým a neskoro získaným hyperandrogenizmom. Týmto protokolom môžeme skúmať samice potomkov z chronicky hyperandrogénnych matiek. Pomocou tohto modelu sa môžeme pokúsiť porozumieť reprodukčným (napr. Vývoj folikulov, ovulácia (Corpora Lutea) a plodnosť) a metabolickým následkom (napr. Metabolizmus glukózy alebo lipidov, zloženie tela, zásoba tukov) (distribúcia). Náš protokol pridáva nový nástroj na vyšetrovanie zvýšených androgénmi indukovaných reprodukčných a metabolických porúch a vzdialení patofyziológie spôsobenej zvýšeným androgénom od tých, ktoré môžu byť spôsobené obezitou. Tento model je možné použiť na štúdium tkanivovo špecifických účinkov zvýšených androgénov u žien. Tu opísanú metodiku na výrobu peliet DHT možno navyše ľahko použiť na štúdium ďalších steroidných hormónov.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.