Indukcia aterosklerotických plátov aktiváciou mineralokortikoidných receptorov v

Zhrnutie

Popisujeme protokol na vyvolanie aterosklerózy v aortálnych koreňoch myší ApoE -/- kŕmených aterogénnou stravou kontinuálnym uvoľňovaním aldosterónu. Tiež sú opísané spôsoby charakterizácie zloženia plakov.

Abstrakt

Úvod

Niekoľko štúdií preukázalo, že aldosterón sa podieľa na vzniku aterosklerózy 8, 9, 10. Infúzia aldosterónu u myší ApoE -/- kŕmených aterogénnou stravou urýchľuje vývoj aterosklerotických lézií indukujúcich zapálený koreň aorty a tvorbu plakov bohatých na lipidy - 10 .

V súhrne popisujeme protokol zahŕňajúci infúziu aldosterónu, aterogénnu stravu, uloženie srdcového tkaniva, kvantifikáciu a charakterizáciu aterosklerotických lézií u myší ApoE -/-. Tento postup podporuje efektívnu tvorbu zapálených aterosklerotických plakov bohatých na lipidy a poskytuje cenný model pre štúdium aterogenézy.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Štúdiu sponzoroval taliansky Národný inštitút výborov pre zdravotnú starostlivosť a použitie, autorizácia č. 493/2016-PR. Všetky postupy boli vykonané v súlade s usmerneniami Európskeho spoločenstva o používaní laboratórnych zvierat (smernica EÚ 2010/63/UE).

Poznámka: Subkutánna implantácia osmotickej minipumpy vehikulom (etanol vo fyziologickom roztoku) alebo aldosterónom (240 µg · kg -1 · d -1) u 8-10 týždňov starých samcov myší nestačí pre gén ApoE. Všeobecne vážia samce myší ApoE -/- vo veku 8 - 10 týždňov približne 25 - 26 g.

  1. 5 mg práškového aldosterónu sa rozpustí v 1 ml absolútneho etanolu.
  2. 68,3 ul fyziologického roztoku. Pridajte 56,7 ul aldosterónu (rozpusteného v etanole), aby ste dosiahli koncentráciu 2,27 μg/ul. kompletne naplňte celú osmotickú minipumpu 125 µL tohto roztoku (maximálna kapacita každej minipumpy je 125 µL).
  3. Použite prietok minipumpou 0,11 ul/h; Preto sa každých 24 hodín uvoľní 2,64 ul roztoku. Podajte každej myši približne 6 µg · d -1 aldosterónu po dobu 28 dní.

(2) plnenie a implantácia osmotickej pumpy

Poznámka: Čerpadlá sa dodávajú v dvoch samostatných častiach: hlavná časť čerpadla a regulátor prietoku.

3. pitva srdca

4. Vyrežte rezy z koreňa aorty

POZNÁMKA: Všetky kroky farbenia uvedené v nasledujúcich protokoloch sa vykonávajú v kyvetách na farbenie skla Coplin.

(6) Analýza obrazu aterosklerotických lézií v koreňových rezoch aorty

Poznámka: Časti koreňa aorty zafarbené olejom Red Red O alebo MAC3 alebo sledovanou protilátkou je možné spracovať pomocou vhodného softvéru (informácie v Tabuľka materiálov), ktoré sa majú analyzovať. Celkové pozitívne vyfarbenie pixelov pre záujmovú zložku je normalizované na celkovú plochu plaku. Snímky boli zhromaždené a analyzované slepým vyšetrovateľom liečby.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Za 8 - 10 týždňov sa myšiam Apo -/- implantoval na infúziu vehikulum alebo aldosterón (obr. 1E-1I) a kŕmili aterogénnou stravou (upravená kalorická diéta 42% z tuku) počas 4 týždňov. Na konci liečby boli myši eutanázované a perfundované PBS s 10% formalínom, ako je opísané vyššie. Koreň aorty sa oddelil od apikálnej časti srdca a bol zaliaty v OAT (obrázok 2). Prierezy koreňov aorty boli pripravené na rôzne zafarbenie pomocou kryostatického prístroja (obrázok 3).

Kompozíciu aterosklerotického plaku je možné charakterizovať zafarbením určitých zložiek, ktoré definujú vývojové štádium plaku. Farbenie olejovou červenou O sa používa na stanovenie obsahu tuku v aterosklerotických léziách, ako je opísané v kroku 5.1, farbenie červenou Picro Sirius sa používa na stanovenie obsahu kolagénu, ako je opísané v kroku 5.2, a farbenie Mac3 sa používa na meranie obsahu makrofágov opísaného v kroku 5.1 5.3. Po 4 týždňoch liečby myšami s aldosterónom došlo k významnému zvýšeniu lipidov (obrázok 4A-4 ° C) a obsah makrofágov (obrázok 4-4F) zobrazené v aterosklerotických plakoch na úrovni koreňa aorty, ale neboli pozorované žiadne rozdiely v obsahu kolagénu (obr. 4)-4I) v porovnaní s myšami liečenými vehikulom. V tomto modeli aldosterón skutočne urýchľuje aterogenézu, vyvoláva vaskulárny zápal, ale nie fibrózu (obrázok 4)).

mineralokortikoidných

Obrázok 1: Príprava a implantácia osmotickej minipumpy vehikulom alebo aldosterónom. Z) Kroky na naplnenie osmotických mini púmp vozidlom alebo aldosterónom. C) Kroky na uzavretie tela čerpadla pomocou regulátora prietoku. D-F) Kroky na vytvorenie rezu na implantáciu pumpy do zadnej časti myši. G-me) Implantácia osmotickej miničerpadla a rez zašiť. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

aktiváciou

Obrázok 2: Pripravte sa na vloženie a vyrezanie srdca a koreňa aorty. Z) srdce je priečne rezané pozdĺž priamky spájajúcej spodné body pravej a ľavej predsiene. Apikálna časť srdca sa spracuje na kvantifikáciu zloženia aterosklerotických lézií v aortálnom koreni. C) koreň aorty zvnútra srdca. D-E) Dutina srdca je naplnená okt. F) Orientácia srdca v členitom tvare vopred naplnenom OCT (so srdcovou dutinou smerom k spodnej časti tvaru) G) Zmrazenie rozrezaného srdca pomocou OCT vo forme. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

indukcia
Obrázok 3. Rezanie koreňa aorty pomocou kryostatického mikrotómu. (A) Predchladzujte kryostat a nastavte správnu teplotu pre stroj a skľučovadlo. B-D) Pevný blok OCT je oddelený od formy a prebytok OCT v oblasti srdca je eliminovaný čepeľou. E-me) Blok OCT je pripevnený kvapalným OCT na podperu. J-K) Podpora je vložená do výstelky a orientovaná ľavou komorou smerom von. L-M) Časť bloku, kým nie je úplne viditeľné členité srdce. N-O) Nastavte hrúbku na 10 alebo 6 µm a zbierajte plátky na skle. P-Q) Pod mikroskopom skontrolujte prítomnosť všetkých troch ventilov. R) Nasledujúce plátky sa zbierajú, ako je to znázornené, kým prestane byť splnená jedna alebo viac chlopní. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

receptorov
Obrázok 4. Kvantifikácia kompozície aterosklerotických plakov Aldosterón - alebo vehikulum ošetrený ApoE -/-. Z) reprezentatívne prierezy červeným olejom O zafarbené prierezy koreňa aorty u 8 - 10 týždňov starých myší ApoE -/- s vehikulom (A.) alebo (B.) Liečil aldosterón a kŕmil aterogénnou stravou počas 4 týždňov. C) Vypočítajte obsah tuku ako percento pozitívneho zafarbenia/celkovej plochy plaku. D-E) Reprezentatívne Mac3 zafarbené prierezy koreňa aorty. F) Kvantifikujte obsah makrofágov ako percento pozitívneho zafarbenia/celkovej plochy plaku. G-H) Reprezentant Picro Sirius zafarbil červené prierezy koreňa aorty. Ja) Kvantifikujte obsah kolagénu ako percento pozitívneho zafarbenia/celkovej plochy plaku. Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± stredná štandardná chyba (SEM; n = 6 pre každú skupinu). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Ateroskleróza je chronické zápalové ochorenie, ktoré postihuje veľké a stredne veľké cievy s interakciami medzi viacerými typmi buniek, ako napr B. Makrofágy, T lymfocyty, endotelové bunky a bunky hladkého svalstva sú priradené k bunkám 1. Napriek obmedzeniam myších aterogénnych modelov existuje veľké množstvo dôkazov o aterosklerotickom procese. Výhodou týchto modelov je rýchle generovanie experimentálnych skupín určitého veku a pohlavia. Myši tiež vykazujú definované a homogénne genetické pozadie.

Vývoj aterosklerotických plakov pozorovaný na myších modeloch náchylných na artériosklerózu čiastočne pripomína subjekty, s výnimkou pozorovania nestabilných plakov 4. Ruptúra ​​plaku a následná trombóza, hlavná príčina infarktu myokardu u ľudí, sa na myších aterogénnych modeloch nepozorovali. V našich publikáciách sme ukázali, že infúzia aldosterónu na vyvolanie nestabilného fenotypu plaku u myší ApoE -/- kŕmených HFD-10 po 4 týždňoch. V skutočnosti táto liečba môže zvýšiť obsah plaku, tuku a úroveň zápalovej oblasti koreňa aorty bez významného rozdielu v porovnaní s obsahom kolagénu 10 u neošetrených myší. Všimnite si, že tieto myši vykazujú zvýšený vývoj aterosklerózy nezávislej na hypertenzii, pretože krvný tlak liečený aldosterónom 10 nebol významne zmenený.

V predloženom rukopise podrobne ukazujeme technický postup zavedenia srdcového tkaniva v októbri, ako aj následné kroky, t.j. H. Analýza koreňov aorty a analýza plakov. V porovnaní s parafínom umožňuje OCT prípravu rezov s vysokým rozsahom hrúbky (1 - 100 um) s mikrotómom kryostatu a minimálnym spracovaním tkanív. Obmedzenia môžu tiež ovplyvniť kvalitu zmrazeného tkaniva, čo potenciálne ovplyvňuje tvorbu ľadových kryštálov, a meniť subcelulárne detaily a produkovať artefakty zistiteľné imunohistologickým farbením. V skutočnosti sa predpokladá, že kryokonzervácia lepšie chráni antigén a antigénnosť. Zmrazené tkanivo v skutočnosti zachováva štruktúru antigénov. Spracovanie zmrazeného tkaniva pre imunohistochémiu vám umožňuje vyhnúť sa použitiu formalínu, ktorý je toxickou a karcinogénnou látkou.

Upozornenie Keď sa objavia tri chlopne, je najlepšie rezať tkanivo na rôzne hrúbky v závislosti od typu vykonávanej analýzy. V skutočnosti sa niektoré podložné sklíčka používajú na určenie progresie plaku, zatiaľ čo zvyšné podložné sklíčka sa dajú použiť na rôzne škvrny (napr. Picro Sirius, Mac3 atď.).

Aterosklerotické lézie u myší liečených aldosterónom vyzerajú bohaté na lipidy a pre makrofágy je charakteristické použitie olejovej červenej O (na farbenie lipidov), Mac3 (na farbenie makrofágmi), Siriusovej červenej (na farbenie kolagénom) alebo iných špecifických požadovaných protilátok Bielkoviny. Je dôležité zdôrazniť, že zavedenie OCT sa na rozdiel od zavedenia do parafínu vyhýba použitiu organických rozpúšťadiel, ktoré odstraňujú lipidový obsah lézií. Preto je lipidové zafarbenie olejovou červenou O možné v rezoch zaliatych OCT a obsah tuku v aterosklerotických plakoch je možné presne kvantifikovať.

V predloženom rukopise sme ukázali, že infúzia aldosterónu je cennou metódou na podporu aterosklerózy u myší ApoE -/-. Podľa toho je infúzia aldosterónu u myší ApoE -/- schopná: 1) zvýšiť aktiváciu endotelových buniek, čo predstavuje zvýšená expresia molekúl podieľajúcich sa na adhézii a migrácii monocytov v počiatočných štádiách tvorby aterosklerotického plaku 12, 13; a 2) obsah lipidov a prozápalových makrofágov na zvýšenie štádia koreňa aorty 10, 13. Tieto účinky nie sú spôsobené hemodynamickými účinkami aldosterónu 10. Stručne povedané, navrhovaný protokol poskytuje platnú metódu na generovanie a charakterizáciu aterosklerózy u myší; To by mohlo monitorovať počiatočné štádiá ochorenia a výsledky terapeutického zásahu a rehabilitácie pri ateroskleróze.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.