Matricové metaloproteinázy a ich inhibítory v priebehu experimentálnej chronickej

Matricové metaloproteinázy a ich inhibítory v priebehu experimentálnej chronickej pankreatitídy.

priebehu

Matricové metaloproteinázy a ich inhibítory v priebehu experimentálnej chronickej pankreatitídy. urna: nbn: de: gbv: 28-diss2010-0068-5

5 Práce 48 6 Zoznam skratiek 51 7 Literatúra 52 8 Poďakovanie 66 9 Vyhlásenie o nezávislosti 67 3

Obrázok 1: Bunkové funkcie pod vplyvom proteolyticky aktívnych MMP. (A) Degradácia ECM a migrácia buniek. (B) indukcia proliferácie alebo apoptózy. (C) Modulácia mediátorov a ich receptorov. (D) Aktivácia ďalších proteáz štiepením ich proenzýmov alebo inhibítorov (Vu a Werb, 2000). 3 Matričné ​​metaloproteinázy sú skupinou viac ako 20 známych proteáz závislých od zinku. Sú schopné rozkladať základné zložky extracelulárnej matrix, ako je kolagén, laminín, fibronektín alebo elastín. Vďaka svojej štruktúre z rôznych domén možno MMP rozdeliť do štyroch skupín: matrylizín, MMP s doménami podobnými hemopexínu, MMP s transmembránovými doménami, MMP s doménami podobnými fibronektínu. Všetky MMP majú oblasť potrebnú na vylučovanie, sú v latentnom stave a majú katalytickú oblasť, ktorá obsahuje aktívne väzbové miesto pre zinok. 53 Klasifikácia MMP je však založená na rozdelení do skupín, ktoré sumarizujú substráty MMP (Tab. 1). 52 13

To platí aj pre proenzýmy. Prekrývanie sa špecifikácie je vysvetlené 50% sekvenčnou homológiou TIMP-1 a TIMP-2. 58,61 Výsledná aktivita MMP závisí od pomeru MMP a TIMP v tkanive. Zmeny v tejto rovnováhe vedú buď k významne zvýšenej proteolytickej aktivite MMPs 59, alebo k zvýšeniu fibrogenézy. 60 Názov TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 Funkcia TIMP-4 Inhibuje Pro-MMP-9 a ďalšie aktívne MMP Inhibuje Pro-MMP-2 a aktívne MMP-2 Nie sú definované. Nie sú definované. Tabuľka 2: Inhibítory tkanív matricových metaloproteináz ( TIMP) a ich funkcie Obrázok 2: Kaskáda aktivácie matrixových metaloproteináz katepsínom a plazmínom. Automatická aktivácia Pro MMP aktívnymi MMP a MT MMP 1. Inhibícia degradácie matrice TIMP. (Evans a kol. 1999) 61 15

Dĺžka amplikónu TIMP 2: 453 bp TIMP 2 Antisense CAA CAG GCG TTT TGC AAT GCA GA dĺžka: 23 bp CCC ATT GAT GCT CTT CTC TGT GA dĺžka 23 bp Vektory pqr2 a pqr3 od spoločnosti Graham M.A. Wells, Neures Limited, Veľká Británia. 2.1.3 Pufre a roztoky Roztok Comassie Blue Roztok DBTC DEPC-H20 O 1 diel ľadovej kyseliny octovej (50 ml) 3 diely izopropanolu (150 ml) 6 dielov H2O (300 ml) Pridajte 0,25 g Comassie Blue do 100 ml (1,25 g). DBTC sa rozpustí v 96% etanole na dve časti. Potom zmiešajte s tromi dielmi glycerolu. Inkubujte 1 L dh20 s 1% DEPC cez noc. Potom deaktivujte DEPC autoklávovaním. Eozín 2,5 g Eozín (farebný index č. 45380) 500 ml H20 HBSS + FCS Mayers Hematoxylín PBS (fosfátový tlmivý roztok) Polyakrylamidový elektroforézny pufor 50 ml HBSS a 15 ml FCS 4%, vložte na ľad. Nasledujúce látky sa rozpustia v 750 ml vody: 50 g síranu hlinitého (KAl (SO4) 2 12H20) 1 g hematoxylínu (farebný index č. 75290) 0,1 g jodidu sodného (NaI03) 1,0 g kyseliny citrónovej 50 g chlorohydrátu Ad H20 do 1 000 ml 120 mM NaCl 170 mm NaH 2P04 3 mm KCl 26 mm KH 2P04, pH 7,2 3,03 g (0,025 M) Tris 14,1 g (0,152 M) glycín 1,0 g (0,1%) SDS na 1000 ml s H20 naplnené. Pufr P1, Qiagen 50mM Tris ph 8,0 10mM EDTA Rnase A (400μg/ml) Pufr P2, Qiagen 200mM NaOH 1% SDS Pufr P3, Qiagen 2,55M KAc ph 4,8 Pufr QBT, Qiagen 750mM NaCl 50mM MOPS 15% Etanol ph 7,0 19

Buffer QC, Qiagen Buffer QF, Qiagen Stop Solution Substrát Buffer TAE Buffer 1L 1M NaCl 50mM MOPS 15% Ethanol Ph 7,0 1,25M NaCl 50mM MOPS 15% Ethanol ph 8,2 25mg Orange G 2,5g Ficoll 400 EDTA 0,5M 50mmol/l Tris ph8 + 5mmol/l CaCl2 242 g Tris 57 ml kyseliny octovej 96% 100 ml EDTA 0,5M ph8 až 1 000 ml H20 dvojitá dest. Tris pufor Tris-HCl 1 M v DEPC-H20, pH 7,4 Tritonový roztok 2,5% 10 ml Triton + 490 ml H20 2.1.4 Bakteriálne kultivačné médium Použitým bakteriálnym kmeňom bol kmeň Escherichia coli DH5 od firmy Gibco BRL (Eggenstein, Nemecko) . Kultivačné médium pre bakteriálny rast sa získalo od Difco Laboratories, Detroit, USA. Platne s agarom s ampicilínom LB Pridajte 100 mg/l ampicilínu na platne s agarom LB. LB agarové platne Luria Bertani (LB) - stredné 5 g kvasnicového extraktu 10 g tryptického peptónu 10 g NaCl aqua dest. 15 g agaru H2O redist na 1 l 5 g kvasnicového extraktu 10 g tryptického peptónu 10 g NaCl aqua dest. Upravte na pH 7,4 H20 redistovanou pomocou 1 N NaOH. na 1 l transformačného tlmivého roztoku 10% (hmotn./obj.) Polyetylénglykol 1500 30 mM MgCl2 v LB-médiu 2.1.5 Súpravy Qiagen Miniprep Qiagen Maxiprep QIAquick Spin RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Nemecko Qiagen, Hilden, Nemecko Qiagen, Hilden, Nemecko Qiagen, Hilden, Nemecko 20