Vývoj metódy LCMSMS na analýzu látok na ochranu polárnych plodín a ich látok
Vedecké centrum Weihenstephan pre výživu, využitie pôdy a životné prostredie Fakulta biologických vied Katedra ekologickej chémie a analýzy životného prostredia Technická univerzita v Mníchove Vývoj metódy LC/MS/MS pre analýzu polárnych aktívnych zložiek v pesticídoch a ich metabolitoch v zberaných plodinách Monica Elena Pantiru Kompletná kópia fakulty Vedeckého centra Weihenstephan pre výživu, využitie pôdy a životné prostredie na Technickej univerzite v Mníchove získať akademický titul dizertačnej práce schválenej doktorom prírodných vied. Predseda skúšajúci dizertačnej práce Univ.-Prof. DR. rer. nat. habil. W. Huber 1. Univ.-Prof. DR. rer. nat. DR. H. c. (RO) A. Kettrup 2. univ.-prof. DR. rer. nat. DR. agr. habil. H. Parlar Disertačná práca bola predložená na Technickú univerzitu v Mníchove 4. mája 2004 a prijatá Weihenstephan Science Center for Nutrition, Land Use and Environment 21. júla 2004.
Poďakovanie Táto práca bola vykonaná v období od októbra 2001 do júla 2004 na Ústave pre ekologickú chémiu, Výskumnom centre pre životné prostredie a zdravie GSF. Rád by som poďakoval nemeckej akademickej výmennej službe za financovanie. Prof. Dr. DR. H. c. Antonius Kettrup Ďakujem veľmi pekne za zaujímavú tému, dobré pracovné príležitosti v ústave a za jeho benevolentnú podporu v každom ohľade. DR. Moje špeciálne poďakovanie patrí Dieterovi Martensovi za dobrý dohľad nad prácou, vedeckú diskusiu, neustálu ochotu pomáhať, rôznorodú podporu, pozornú nápravu tejto práce a jeho radosť z vyučovania. DR. Rád by som poďakoval Patrickovi Bohnovi za rady, prebiehajúce diskusie a veľmi dobrú spoluprácu. Obzvlášť by som sa chcel poďakovať pani Věre Meyerovej a pánovi Stephanovi Forsterovi za aktívnu podporu pri spracovaní vzoriek a dobrú spoluprácu. Karin Fischer, Dr. Jutta Lintelmann, Dr. Georg Matuschek, Dr. Zvlášť by som sa chcel poďakovať Willibaldovi Kammovi, Agnes Feketeovej a Dariuszovi Antkowiakovi za vynikajúcu pracovnú atmosféru.
Obsah 1 Úvod. 1 2 Ciele práce. 5 3 Súčasný stav výskumu a teoretické princípy. 6 3.1 Vývoj multi-metód. 6 3.2 Postupné kroky v klasickej viacnásobnej metóde na analýzu pesticídov. 7 3.2.1 Príprava vzorky. 7 3.2.2 Ťažba. 7 3.2.3 Čistenie. 10 3.2.4 Inštrumentálna analýza. 16 3.2.4.1 Chromatografické metódy. 16 3.2.4.2 ďalšie metódy stanovenia. 21 3.3 Hmotnostná spektrometria. 23 3.3.1 Spojovacie techniky. 23 3.3.1.1 ESI. 24 3.3.1.2 APCI. 24 3.3.1.3 APPI. 25 3.3.2 Systémy hmotnostného analyzátora. 26 3.3.2.1 Zrýchlenie. 27 3.3.2.2 Hmotnostný spektrometer. 27 3.3.2.3 Rozpustenie. 30 3.3.3 MS/MS. 31 3.4 Maticové efekty v LC/MS. 33 4 Materiály a metódy. 36 4.1 Použité zariadenia. 36 4.2 Použité materiály. 38 4.3 Štatistické a matematické metódy. 43 4.3.1 Štatistické metódy. 43 4.3.2 Matematické metódy. 44 4.4 Ďalšie informácie. 45 5 výsledkov. 46 5.1 Separácia a detekcia. 46 5.1.1 Optimalizácia ionizácie. 47
5.1.2 Stanovenie najintenzívnejších rodičovských a dcérskych iónov a optimalizácia detekčných parametrov závislých od látky. 48 5.1.3 Výber zdroja ionizácie (porovnanie ESI-APCI). 5.1.4 Metóda HPLC. 59 5.1.4.1 Predbežné testy s HPLC-DAD. 59 5.1.4.2 Eluenty. 60 5.1.4.3 Separačné stĺpce. 61 5.1.4.4 HPLC gradienty. 62 5.1.4.5 Okno kontroly. 66 5.1.5 Zvýšenie citlivosti. 67 5.1.5.1 Porovnanie modifikátorov. 67 5.1.5.2 Injekčné objemy. 68 5.1.6 Charakteristiky inštrumentálnej analýzy. 5.1.6.1 Stanovenie medze detekcie a hranice kvantifikácie. 68 5.1.6.2 Kalibračné funkcie. 70 5.1.6.3 Presná skúška metódy LC/MS/MS. 72 5.2 Optimalizácia extrakcie. 73 5.2.1 Predbežné skúšky. 73 5.2.2 Vplyv hodnoty ph. 73 5.2.3 Rozpúšťadlá. 74 5.2.4 Extrakcia matíc s vysokým obsahom tuku. 77 5.2.5 Extrakcia suchých matríc. 82 5.3 Čistenie extraktov. 5.3.1 Čistenie acetónových extraktov. 5.3.1.1 Čistenie GPC. 83 5.3.1.2 Testovanie rôznych tuhých fáz na čistenie extraktu. 87 5.3.1.3 Vplyv matice. 90 5.3.2 Čistenie metanolových extraktov. 93 5.3.2.1 ChemElut (Hydromatrix). 93 5.3.2.2 Oáza HLB. 96 5.3.2.3 EnviCarb. 97 5.3.2.4 Chromabond-HRP. 5.3.2.5 Účinnosť tuhej fázy HRP na čistenie extraktov vzoriek. 99 5.3.2.6 Porovnanie ChemElut a HRP. 105
5.3.3 Čistenie acetonitrilových extraktov. 109 5.3.3.1 C18. 109 5.3.4 Experimenty s Oasis MCX. 114 5.4 Vyšetrovania zamerané na zníženie alebo vylúčenie účinkov matice. 114 5.4.1 Vplyvy matice. 114 5.4.2 Čistenie extraktu. 114 5.4.2.1 Porovnanie GPC, Hydromatrix a SPE. 114 5.4.2.2 Porovnanie extrakčných rozpúšťadiel. 118 5.4.2.3 Matice bohaté na tuky. 119 5.4.3 Kvantifikácia pomocou externých štandardov. 5.4.4 Kvantifikácia pomocou štandardov označených izotopmi. 121 5.4.5 Kvantifikácia pomocou maticových štandardov. 123 5.5 Validácia metódy. 125 5.5.1 Špecifikácia metódy. 125 5.5.2 Analytické parametre a štatistické vyhodnotenie. 5.5.2.1 Limity stanovenia a slepé hodnoty. 128 5.5.2.2 Miera obnovy a opakovateľnosť. 130 6 Zhrnutie. 141 7 Výhľad. 143 8 Bibliografia. 144 9 Príloha. 157