DIPLOMOVÁ PRÁCA. Názov diplomovej práce Bezpečnosť a hygiena potravín v domácnostiach: Kvantifikácia toxínov súvisiacich s výrobou

MASTER'S THESIS Názov diplomovej práce Bezpečnosť potravín a hygiena v súkromných domácnostiach: Kvantifikácia toxínov súvisiacich s výrobou Autor Michael Steininger, Bakk.rer.nat Požadovaný akademický titul Master of Science (MSc) vo Viedni, 2012 Číslo štúdie podľa študijného listu: Oblasť štúdia podľa študijného listu: Vedúci: A 066 838 Magisterský program v odbore výživové vedy doc. DR. Petra Rust

I Obsah 1. Úvod a otázka. 1 2. Prehľad literatúry. 4 2.1 Akrylamid 4 2.1.1 Úvod a mechanizmus tvorby. 4 2.1.2 Toxicita. 7 2.1.3 Expozícia človeka . 11 2.1.4 Posúdenie rizika 15 2.2 Furan . 17 2.2.1 Iniciácia a mechanizmus tvorby 17 2.2.2 Toxicita 20 2.2.3 Expozícia človeka. 23 2.2.4 Posúdenie rizika 27 2.3 Polycyklické aromatické uhľovodíky. 28 2.3.1 Úvod a mechanizmus tvorby . 28 2.3.2 Toxicita 30 2.3.3 Expozícia človeka . 33 2.3.4 Posúdenie rizika 38 2.4 Trans-mastné kyseliny . 40 2.4.1 Úvod a mechanizmus tvorby 40 2.4.2 Účinky na zdravie 42 2.4.3 Expozícia človeka. 45 2.4.4 Posúdenie rizika 47 3. Materiál a metódy 49 3.1 Nábor testovaných a testovaných osôb . 49 3.2 Použité potraviny 51 3.3 Odber vzoriek vrátane použitého vybavenia . 54 3.4 Použité metódy 56 3.4.1 Systém pozorovania 56 3.4.2 Dotazník. 57 3.5 Analytické metódy 58 3.5.1 LC/MS stanovenie akrylamidu 58

II 3.5.2 Stanovenie furánu GC/MS. 60 3.5.3 Stanovenie polycyklických aromatických uhľovodíkov pomocou HPLC 62 3.5.4 Stanovenie metylesterov mastných kyselín pomocou GC-FID 64 3.6 Štatistický postup. 65 4. Výsledky a diskusia 66 4.1 Hladiny akrylamidu v vyprážaných zemiakoch 66 4.2 Hladiny furánu v vyprážaných zemiakoch . 77 4.3 Polycyklické aromatické uhľovodíky v vyprážaných zemiakoch a kurčatách. 79 4.4 Hladiny trans-mastných kyselín. 87 4.5 Výsledky ďalších prieskumov. 90 4.6 Diskusia. 95 5. Záver. 107 6. Zhrnutie 110 7. Zhrnutie. 114 8. Bibliografia. 117 9. Životopis. 134

III Zoznam obrázkov Obr. 1 Mechanizmus tvorby akrylamidu 5 Obr. 2 Štruktúrny vzorec furánu a dibenzofuránov . 17 Obr. 3 Testy normálneho rozdelenia nameraných hodnôt akrylamidu Kolmogorov-Smirnov a Shapiro-Wilk. 68 Obr. 4 QQ diagram akrylamidu - Namerané hodnoty (koncentrácie v µg/kg). 68 Obr. 5 Boxplot nameraných hodnôt akrylamidu (v µg/kg) porovnanie medzi rodinami a seniormi 69 Obr. 6 Grafický boxplot na zobrazenie typov oleja použitého na prípravu vyprážaných zemiakov v súvislosti s nameranými koncentráciami akrylamidu (v µg/kg ) v konečnom produkte. 70 Obr. 7 Krabicový graf varených a nevarených zemiakov (pred vyprážaním) a obsahu akrylamidu (v µg/kg) v konečnom produkte. 73 Obr. 8 Boxplot Odrody zemiakov a koncentrácia akrylamidu v konečnom produkte použitom v štúdii (v µg/kg). 75 Obr. 9 Oleje/tuky používané na prípravu kuracieho mäsa v percentách (všetky domácnosti) 90 Obr. 10 Oleje/tuky používané na vyprážané zemiaky v percentách (všetky domácnosti). 91 Obr. 11 Prieskum typu sporáka v percentách (všetky domácnosti). 92 Obr. 12 Skladovanie olejov a tukov použitých pri pečení kurčaťa. 93 Obr. 13 Skladovanie olejov a tukov použitých pri pečení Boli použité zemiaky 94

V Zoznam skratiek AGES Rakúska agentúra pre zdravie a bezpečnosť potravín ALARA. Rovnako nízke ako primerane dosiahnuteľné ApoB. Apolipoproteín B BaP. Benzo (a) pyrén BfR Federálny inštitút pre hodnotenie rizík BMDL 10. referenčná dávka dolná hranica spoľahlivosti 10% - dolná hranica spoľahlivosti referenčnej dávky 10% BMG . Spolkové ministerstvo zdravotníctva (Rakúsko) BVL. Spolkový úrad pre ochranu spotrebiteľa a bezpečnosť potravín CIAA. Konfederácia potravinárskeho a nápojového priemyslu Európskej únie Panel CONTAM . Kontaminanty v potravinovom reťazci DA-CH Nemecká spoločnosť pre výživu, Rakúska spoločnosť pre výživu, Švajčiarska spoločnosť pre výskum výživy, Švajčiarska asociácia pre výživu DFG . Nemecká nadácia pre výskum DNA. Kyselina deoxyribonukleová DTU . Danmarks Tekniske Universitet (Technická univerzita v Dánsku) EK. Európska komisia EFSA Európsky úrad pre bezpečnosť potravín (Európsky úrad pre bezpečnosť potravín EPA . Americká agentúra na ochranu životného prostredia EÚ. Európska únia FAO/WHO Organizácia OSN pre výživu a poľnohospodárstvo Health Organization FDA. US Food and Drug Administration FFQ. Question-Frequency-Questionnaire

GC-FID. Detektor plynovej chromatografie - plameňovej ionizácie GC-MS. Plynová chromatografia - hmotnostná spektrometria GPC . Gélová permeačná chromatografia HDL. Vysoko hustá lipoproteínová HPLC Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia IARC.Medzinárodná agentúra pre výskum rakoviny IPCS.Medzinárodný program pre chemickú bezpečnosť ISTD. Interná norma JECFA. Spoločný odborný výbor FAO/WHO pre prídavné látky v potravinách (Spoločný odborný výbor FAO/WHO pre prídavné látky v potravinách) LB.Low.Bound LC/MS . Kvapalinová chromatografia - hmotnostná spektrometria LD 50. Priemerná letálna dávka (50%) LDL lipoproteín s nízkou hustotou MAK.Maximálna koncentrácia na pracovisku MOE.Margin expozície stredná hodnota MW NTP . Národný toxikologický program PAH . Polycyklické aromatické uhľovodíky PAK Polycyklické aromatické uhľovodíky (= PAH) ppb častí na miliardu Q diagram. Kvantilovo-kvantilový diagram RP stĺpec. Kolóna s reverznou fázou SCF . Vedecký výbor pre potraviny SD. Štandardná odchýlka SIM Sledovanie vybraných iónov SNFA Švédska národná správa potravín SPE . Extrakcia na pevnej fáze TFA trans-mastné kyseliny TFS trans-mastné kyseliny TNFα. Faktor nekrózy nádoru-α UB. Horná hranica VI

VII POĎAKOVANIE Na tomto mieste by som sa chcel poďakovať všetkým, ktorí ma podporili pri realizácii a príprave tejto diplomovej práce. Špeciálne poďakovanie patrí mojim rodičom za emocionálnu a finančnú podporu počas celého kurzu.

3 zemiaky používali oleje a tuky testované na výskyt transmastných kyselín. Cieľom je skontrolovať, či je v jednotlivých prípadoch prekročená maximálna hodnota 2g trans-mastných kyselín stanovená v rakúskom predpise pre trans-mastné kyseliny v celkovom tuku a či je možné predpokladať, že analyticky stanovené namerané hodnoty predstavujú zdravotné riziko pre človeka [BMG, 2009].

5 Obrázok 1: Mechanizmus tvorby akrylamidu [Mottram et al., 2002; Stadler a kol., 2004; Granvogl a Schieberle, 2006]. Skúmali sa a diskutovali sa ďalšie sekundárne reakčné cesty tvorby akrylamidu v potravinách, napr. tvorba akrylamidu z akroleínu, kyseliny akrylovej a pšeničného lepku. Objavuje sa tvorba akrylamidu z akroleínu v neprítomnosti asparagínu

6 zohrávajú úlohu najmä v potravinách s vysokým obsahom tuku [Yasuhara et al., 2003]. Kyselina akrylová, ktorá vzniká z akroleínu, môže reagovať s amoniakom a viesť tak k tvorbe akrylamidu. Tento mechanizmus však nie je spojený s tvorbou akrylamidu vo vyprážaných zemiakoch [Becalski et al., 2003; Yaylayan a kol., 2005]. Použitím suchého a čisteného pšeničného lepku sa ukázalo, že pri pyrolýze proteínov môže dôjsť k významnej tvorbe akrylamidu [Claus a kol., 2006]. Okrem toho môže byť akrylamid generovaný deamináciou 3-aminopropionamidu (3-APA), medziproduktu Maillardovej reakcie [Granvogl a Schieberle, 2006].

19 je najpravdepodobnejšie, že sa u nich vyvinie furán. Ďalej tento projekt skúmal, či domáce výrobky pripravené z prísad, ktoré pôvodne obsahovali furán, tvorili počas procesu varenia ďalší furán. Tu však nedošlo k zvýšeniu obsahu furánu počas varenia [DTU, 2009; EFSA, 2009]. Ďalšie výskumy tvorby furánu pri zahrievaní potravín ukazujú, že hoci sa pri zahrievaní vytvára, nehromadí sa v nádobách bez viečka. Na druhej strane sa furán prednostne hromadí v tepelne upravených konzervách a konzervovaných potravinách, pretože tieto nádoby sú uzavreté a sú vystavené značnému tepelnému namáhaniu [Hasnip et al., 2006].

22 možných karcinogénnych účinkov na ľudí. Metaanalýza dokonca poukazuje na inverznú asociáciu medzi konzumáciou kávy a hepatocelulárnymi karcinómami [Bravi et al., 2007]. V tomto prípade je potrebné vziať do úvahy, že káva obsahuje veľké množstvo chemických zlúčenín, o ktorých sa predpokladá, že majú antioxidačné a antikarcinogénne vlastnosti [Cavin et al., 2002; Higdon a Frei, 2006]. Tieto zlúčeniny môžu mať nie zanedbateľný vplyv na vývoj rakoviny [Bakhiya a Appel, 2010].

48 Príjem sa v niektorých krajinách EÚ znižuje v dôsledku nových výrobných technológií [EFSA, 2004]. V potravinárskom priemysle sa v zásade používajú štyri možné technológie na čo najväčšie zníženie obsahu trans-mastných kyselín. Patria sem modifikácia hydrogenačného procesu (úprava tlaku, teploty, katalyzátora), enzymatická transesterifikácia (vedie k zmene teploty topenia a kryštalizačného správania) a použitie olejov, ktorých vlastnosti sa zlepšili (oleje bohaté na kyselinu olejovú; oleje so stredným obsahom kyselina olejová a oleje s nízkou koncentráciou kyseliny linolénovej) a použitie frakcií, ktoré sú bohaté na pevné látky z prírodných olejov, ako sú kokosový, palmový a palmojadrový olej [Dhaka et al., 2011]. V zhode so správou EFSA ďalší autori ukazujú, že hladiny transmastných kyselín v niektorých výrobkoch klesajú, ale niektoré skupiny potravín, ako sú pečivo, cukrovinky, rýchle občerstvenie a mikrovlnná rúra, sú stále relatívne vysoké [EFSA, 2004; Kuhnt a kol., 2011; Lehner, 2007].

53 Poskytnuté jedlo nakrájajte a vložte do nádoby na šalát. Testované osoby boli požiadané, aby šalát marinovali s octom alebo olejom, pretože by to mohlo viesť pri laboratórnych analýzach k problémom pri analýze. Povolené bolo solenie, korenie a dochutenie šalátu bylinkami. Testované osoby mohli použiť vlastné korenie na celý proces varenia, ako kompenzáciu bolo po uvarení odovzdané balenie korenia a olivový olej [Hoelzl et al., 2011].

57 3.4.2 Dotazník Počas druhej domácej návštevy dostali testované osoby vyplnený dotazník s cieľom vyhodnotiť správanie pri zaobchádzaní s potravinami, ako aj vedomostné deficity a nebezpečenstvá v domácnostiach. Výsledky pozorovaní a dotazníky majú preukázať akékoľvek nezrovnalosti medzi informáciami poskytnutými účastníkmi štúdie a skutočným správaním [Hoelzl et al., 2011]. Dotazník bol však špeciálne navrhnutý pre mikrobiologickú časť tejto observačnej štúdie, a preto práve tento Diplomová práca nejde podrobne o príslušné výsledky a interpretáciu odpovedí účastníkov štúdie [Mayerhofer, 2012].

59 (230 g/l octanu zinočnatého, 3% kyseliny octovej) bola odmerná banka znovu naplnená vodou. Extrakt sa potom prefiltroval cez zložený filter do kadičky. Analyt bol potom identifikovaný a kvantifikovaný pomocou LC/MS (single quad) [AGES, 2008; Hoelzl a kol., 2011].

61 Furan a d4-furán zariadenia určené v režime SIM/SCAN. Pomocou externe generovanej kalibračnej linky sa obsah furánu stanovil zmeraním základnej koncentrácie vzorky. Získaný výsledok bol potvrdený aj dodatočným stanovením obsahu furánu vo vzorke pomocou dvoch prímesí [FDA, 2004; VEK, 2008; Hoelzl a kol., 2011].

Pridá sa 63 etanolového roztoku hydroxidu draselného, 100 ul roztoku benz (a) antracénu a 20 ml vody. Roztok sa zahrieva k varu pod spätným chladením. Po extrakcii za horúca sa spodná časť zmesi s obsiahnutou vzorkou preniesla do oddeľovacieho lievika a pretrepala s cyklohexánom. Po odstránení spodnej fázy sa extrakt premyl šesťkrát vodou a organická fáza sa prefiltrovala cez zložený filter do banky s guľatým dnom. Po pridaní cyklohexánu a dekánu sa zmes zahustila na rotačnej odparke a získaný zvyšok sa mohol preniesť do banky s petroléterom a doplniť (= extrakt vzorky). Po vyčistení pomocou separačných kolón SPE sa eluát skoncentroval, potom sa pridali 2 ml acetonitrilu, znova sa zahustil a odvážil. Získaný extrakt sa potom prefiltruje cez filter injekčnej striekačky (= roztok vzorky). Detekcia polycyklických aromatických uhľovodíkov sa uskutočňovala pomocou HPLC, pri ktorej sa 20 ul injekčných roztokov a štandardných roztokov separovalo na RP kolóne a detegovalo sa pomocou fluorescenčného alebo UV detektora [AGES, 2010; Hoelzl a kol., 2011].

Ak zjete 500 g vyprážaných zemiakov, viedlo by to k značne vysokému príjmu akrylamidu. Ak sa konzumujú vyprážané zemiaky alebo hranolky často alebo ak sa potraviny bohaté na akrylamid konzumujú vo veľkom množstve, existuje vážne zdravotné riziko pre týchto ľudí, ak uvážime uvádzanú hodnotu MOE 50 (pre vysoko exponované skupiny ľudí) [EFSA, 2011; FAO/WHO, 2011]. Pri uskutočňovaní tejto observačnej štúdie nebolo prirodzene možné zaznamenať príslušné teploty vyprážania, čo nepochybne predstavuje obmedzenie výpovednej hodnoty výsledkov, pretože vývoj teploty zohráva podstatnú úlohu pri tvorbe akrylamidu v potravinách [Stadler a Scholz, 2004; Stadler a kol., 2002; Zyzak a kol., 2003]. Táto pozorovacia štúdia by však mala slúžiť na preskúmanie vplyvu jednotlivých postupov varenia, ako je dlhodobé opekanie zemiakov alebo varenie/nevarenie zemiakov pred vyprážaním, na koncentráciu akrylamidu v konečnom produkte. Doba praženia zemiakov varených pred pražením bola samozrejme v priemere kratšia ako doba pred pražením.-

106 možno použiť dotazník na vyhodnotenie, či existujú nejaké poznatky o nebezpečenstve toxínov súvisiacich s výrobou [Mayerhofer, 2012]. Výhľad Pretože v tejto štúdii sa varilo iba jedno jedlo, je ťažko možné vyvodiť závery o skutočnej expozícii jedlu z nameraných hodnôt určených pre akrylamid, furán, polycyklické aromatické uhľovodíky a transmastné kyseliny. Použitie dotazníka potravinovej frekvencie (FFQ) by bolo vhodné na poskytnutie presnejších informácií o expozícii človeka požitými potravinami alebo na určenie, či sú určití účastníci štúdie zvlášť ohrození vysokými koncentráciami týchto zlúčenín s dennou dávkou. Požitie potravy. Ďalšou možnosťou na zaznamenanie množstva týchto toxínov požitých ľuďmi by bol biomonitoring človeka, nástroj, ktorý sa považuje za ideálny pre vhodné riadenie rizík alebo zodpovedajúce hodnotenie rizík chemických látok [Angerer et al., 2007].

109 Vo výsledku teda neexistujú žiadne komparatívne hodnoty, ktoré by umožnili vyvodiť zmysluplné závery, pokiaľ ide o rizikové produkty. Ani vzorky vyprážaných zemiakov, ani vzorky oleja a tuku nevykazovali rušivé výsledky týkajúce sa tukov. Všetky vzorky poskytli koncentrácie transmastných kyselín 2 g TFS v celkovom tuku. Preto boli všetky vzorky pod maximálnou hodnotou 2% trans-mastných kyselín v celkovom tuku stanovenou v rakúskom nariadení o trans-mastných kyselinách [BMG, 2009]. V súhrne možno konštatovať, že pri príprave smažených zemiakov v domácnostiach môžu byť v niektorých prípadoch produkované vysoké koncentrácie akrylamidu. Ak sa vezme do úvahy stredná hodnota a stredná hodnota (98,5 µg/kg) koncentrácie akrylamidu, je potrebné konštatovať, že v priemere neexistujú žiadne alarmujúce hodnoty, a preto nie sú potrebné povinné opatrenia na minimalizáciu. Táto skutočnosť je okrem iného spôsobená skutočnosťou, že v žiadnej zo skúmaných súkromných domácností neboli pozorované žiadne silno spálené vzorky vyprážaných zemiakov. Obsah furánu a trans-mastných kyselín v vyprážaných zemiakoch nepredstavuje zdravotné riziko, ani tuky a oleje.

113 sa stáva dôležitejšou. Niektoré živočíšne a rastlinné tuky/oleje majú veľmi vysoké koncentrácie PAH (benzo (a) pyrén, chryzén, benz (a) antracén, benzo (b) fluórantén), a preto sú klasifikované ako zdraviu nebezpečné. Okrem toho nie je možné poskytnúť informácie o zvlášť problematických olejoch a tukoch, pretože živočíšne tuky (maslo) aj rastlinné oleje, ako je repkový a olivový olej, majú niekedy vysoké koncentrácie (> 10 µg/kg pre skupinu PAH4) PAH.