Embryonované kuracie vajce - biológia
Aké horúce je príliš horúce na život hlboko pod dnom oceánu?
Antibiotiká z baktérií
Migrácia buniek: novoobjavená funkcia známeho proteínu
Molekulárny kompas na zarovnanie buniek
Čo robí listy na jeseň starnúcimi
Demokracia perličiek
Prostredie spoločnosti Ekembo: Ľudia tiež žili v otvorenej krajine
| Genetika | Poľnohospodárstvo, lesníctvo a chov zvierat
Pšeničná odroda vznikla krížením divých tráv
Aké horúce je príliš horúce na život hlboko pod dnom oceánu?
Embryonované kuracie vajce
Technika embryonovaného kuracieho vajca
Na množenie vírusov sa používajú iba kuracie vajcia z infekčne kontrolovaných populácií kurčiat, pretože embryo nesmie byť vopred infikované prírodnými patogénmi, ktoré spôsobujú choroby kurčiat. Tieto vajcia sa tiež nazývajú bez špecifikovaných patogénov (Vajcia SPF). Aby sa získala vhodná veľkosť embrya, oplodnené kuracie vajcia sa ďalej inkubujú v špeciálnych inkubátoroch po dobu 5 až 14 dní pri 38 ° C a relatívnej vlhkosti 60%, v závislosti od neskôr zvolenej techniky infekcie. Tieto inkubátory majú aj zariadenie na obracanie, ktoré pravidelne pohybuje vajíčkami. Pomocou špeciálnej fluorescenčnej obrazovky je možné pozorovať vývoj embrya po odstránení vajíčok („čistom“), utriedení mŕtvych alebo neoplodnených vajíčok.
Očkovanie príveskových orgánov
Spravidla sa nenaočkuje samotné embryo, ale jeho prívesné orgány. V závislosti od druhu vírusu alebo otázky (rozmnožovanie alebo detekcia vírusu) ide o žĺtkový vak, amnion, alantois alebo chorionická alantoidná membrána (CAM). Pretože tieto ukazujú optimálnu veľkosť pre inokuláciu a náchylnosť k vírusom v rôznych časoch počas embryonálneho vývoja, dĺžka inkubačnej doby použitých vajíčok je tiež odlišná. Najlepší čas na infekcie žĺtkového vaku je 5 až 7 dní po oplodnení, pre amnion a alantois 10 dní, pre CAM 11 až 12 dní. Ak dôjde k očkovaniu príliš skoro, orgán slepého čreva nie je dostatočne veľký, ak dôjde k oneskoreniu, úspešnej infekcii môže zabrániť čoraz viac inhibičných vplyvov imunitného systému (vrátane tvorby imunoglobulínu Y) alebo znižujúca sa citlivosť orgánov.
Očkovanie sa vykonáva za sterilných podmienok, aby sa zabránilo bakteriálnej kontaminácii. Po dezinfekcii sa vaječná škrupina otvorí malým razníkom. Keď je CAM naočkovaný, deje sa to na strane vajíčka, na ktorej leží embryo zvnútra; vo všetkých ostatných orgánoch prívesku je otvorený tupý vaječný pól. Asi 0,1 až 0,2 ml kvapaliny obsahujúcej vírus (inokulum) sa vstrekne do vhodnej štruktúry pomocou kanyly. Potom je misa uzavretá lepidlom alebo voskom. Po ďalšom dni inkubácie sa vajíčka skontrolujú pomocou osvetľovacieho zariadenia a mŕtve embryá sa vytriedia ako poškodenie očkovaním. Po ďalších 1 až 6 dňoch sa môžu množené vírusy získať z alantoidnej alebo plodovej vody (vaječný bielok) alebo z membrány CAM a žĺtkového vaku. Vajíčko sa predtým uskladní cez noc pri 4 ° C, aby embryo zomrelo a zúžili sa cievy. Na získanie čo najčistejších vírusových prípravkov obvykle nasledujú ďalšie purifikačné kroky, ako je filtrácia alebo ultracentrifugácia.
Posúdenie vývoja embryí
Naočkované vajíčka sa pravidelne, zvyčajne každý deň, röntgenujú a hodnotí sa vývojový stav embrya. Ak je vylúčená bakteriálna kontaminácia a poškodenie očkovaním, smrť embrya môže naznačovať replikáciu vírusu, čo možno pozorovať napríklad po naočkovaní žĺtkového vaku vírusmi herpes simplex. Ďalšími makroskopicky viditeľnými znakmi replikácie vírusu sú zvýšené vaskulárne znaky v embryu, príznaky zápalu, petechiálne krvácanie alebo malformácie. Po očkovaní vírusmi kiahní, vírusmi herpes simplex a vírusom Rousovho sarkómu nastávajú na CAM tmavé, škvrnité zmeny, tzv. „Pocks“. Sú také charakteristické, že sa dajú použiť na stanovenie diagnózy, keď sa zistí vírus. Vo väčšine prípadov nasledujú rôzne ďalšie vyšetrenia na identifikáciu patogénu, napríklad elektrónové mikroskopické vyšetrenie, hemaglutinačný test alebo priama detekcia vírusových zložiek (antigény a nukleové kyseliny) na presnú typizáciu.
Dôležitosť diagnostiky vírusov
Dôležitosť embryonovaného slepačieho vajca pre izoláciu vírusu a diagnostiku vírusu je obmedzená, v prípade ľudských vírusov sa v súčasnosti obmedzuje na izoláciu a typizáciu chrípkových vírusov. Pri izolácii neznámych nových patogénov sa okrem molekulárnych metód, bunkovej kultúry a elektrónovej mikroskopie používajú aj embryonované slepačie vajcia. Vo veterinárnej medicíne sa vo vaječnej kultúre pestuje množstvo patogénov, vrátane zástupcov vírusov kiahní, ortomyxovírusov, herpes vírusov, togavírusov a rôznych vtáčích vírusov. Nasledujúca tabuľka poskytuje prehľad najdôležitejších patogénov a ich správania v embryonovaných slepačích vajciach. Niektoré vírusy sa môžu úspešne množiť a s prijateľným výťažkom v slepačích vajciach, iba ak bol divoký typ adaptovaný na slepačie vajce prostredníctvom niekoľkých pasáží (slepé pasáže).
Produkcia vakcíny v embryonovanom slepačom vajci
Veľkou výhodou replikácie vírusu v embryonovaných slepačích vajciach je vysoký výťažok vírusu. Táto sa používala pri výrobe rôznych vakcín už v 60. rokoch, napríklad na získanie dostatočného množstva suroviny pre mŕtve vakcíny (rozdelené vakcíny) proti vírusu osýpok a rôznym chrípkovým vírusom. Najmä pri druhom z nich reprodukcia v bunkových kultúrach ešte nedosiahla dostatočne vysoké koncentrácie vírusu, takže embryonované slepačie vajce určuje priemyselnú výrobu chrípkových vakcín dodnes. Problémom tejto metódy je však časovo náročné čistenie vaječného materiálu, ktoré vždy zanecháva stopy vaječných bielkovín, a preto ho nemožno podať, ak existuje alergia na kuracie bielkoviny.