Enzymatická oligomerizácia potravinárskych bielkovín pri vysokotlakových reakčných miestach a
Enzymatická oligomerizácia potravinových bielkovín pod vysokým tlakom: reakčné miesta a funkčné dôsledky DIZERTÁCIA pre získanie akademického titulu Doctor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) Prezentované na Fakulte matematiky a prírodných vied Technickej univerzity v Drážďanoch Susanne Schuh Predložené 10. decembra 2012 Dizertačná práca bola v r. od septembra 2007 do júla 2012 na profesúre potravinárskej chémie.
Spor: 25. apríla 2013 Recenzent: Prof. Dr. rer. nat. Dr.-Ing. habil. Thomas Henle prof. Dr. rer. nat. Haršadrai Ravel
Obsah Obsah Zoznam obrázkov V Zoznam tabuliek VIII Zoznam skratiek XI 1 Úvod a ciele 1 2 Teoretické základy 3 2.1 Lyzozým. 3 2.1.1 Mechanizmy účinku lyzozýmu. 4 2.1.2 Možné použitia lyzozýmu. 7 2.1.3 Modifikácia lyzozýmu. 8 2.1.3.1 Fibrily a amyloidné štruktúry HEWL. 9 2.1.3.2 Nové biologické funkcie prostredníctvom zmeny konformácie. 13 2.1.4 Evolučný vývoj a vzťah k α-laktalbumínu. 14 2.2 Enzymatické zosieťovanie. 15 2.2.1 Mikrobiálna transglutamináza. 15 2.2.1.1 TGázou katalyzované reakcie a reakčný mechanizmus. 17 2.2.1.2 Analytické aspekty. 19 2.2.1.3 Použitie v potravinárskom priemysle. 19 2.3 Neenzymatické zosieťovanie. 21 2.3.1 Tepelne indukované zosieťovanie. 21 2.3.2 Zosieťovanie nulovej dĺžky vo vákuu. 23 2.3.3 Možné použitia neenzymaticky viazaných proteínov. 23 2.4 Účinok vysokých hydrostatických tlakov na bielkoviny. 24 2.4.1 Vplyv vysokého tlaku na kurací bielkovinový lyzozým. 26 2.4.2 Vplyv vysokého tlaku na mikrobiálnu transglutaminázu. 27 3 Experimentálna časť 29 3.1 Chemikálie, materiály, prístroje a softvér. 29 3.1.1 Chemikálie. 29 3.1.2 Zariadenia a spotrebný materiál. 31 3.1.3 Skúšobné materiály. 33 3.1.4 Softvér. 33 I.
Obsah 4.6.2 Identifikácia vytvorených izopeptidov. 146 4.6.3 Porovnanie neenzymatického a enzymatického zosieťovania HEWL.146 4.6.4 Porovnanie vákuového tepelného zosieťovania HEWL s β-kazeínom a prvé vyšetrenia na izoláte srvátkového proteínu. 149 4.7 Záver štúdií o enzymatickom a neenzymatickom zosieťovaní rôznych proteínov. 152 5 Zhrnutie 154 6 Bibliografia 157 Publikácie 172 Poďakovanie 173 Poistenie 174 IV
Zoznam skratiek LMW a-la β-lg Lys m/z Met min ML MMW MO MPa MS mtgáza NRT PBS PCR pdb rel. PE RP-HPLC rpm SDS-PAGE TCA TEM TEMED TGase ThT TPCK Tris U UV Val WHO Z-Glu-Gly ZLCL vzorka nízkeho zosieťovaného lyzozýmu s 1 000 37 C Arnaudov a de Vries, 2005 ph 2,0; 57 C 4,0 ± 0,7> 5 000 Wang a kol. 2009a ph 2,0; 55 ° C
10 * 1 000 * Frare a kol., 2004 ph 2,0; 65 ° C
10 *> 600 * Cao a kol., 2004, pH 4,5; Izbová teplota; červená. HEWL, 90% etanol Goda et al., 2000 90% etanol, 10 mm NaCl, 25 C * odhadované pomocou TEM snímok 2-5 1000-2000
2 Teoretické základy Okrem toho Menéndez (2006) dokázal, že pri nižších teplotách 20 C a 600 MPa sa čas potrebný na 50% inaktiváciu zvyšuje na zhruba 100 minút (šesťnásobne). Enzým je ďalej merateľne inhibovaný iba pri izbovej teplote od 400 MPa alebo pri atmosférickom tlaku od 60 ° C. Na základe týchto zistení sa tlaková citlivosť transglutaminázy zvyšuje so zvyšujúcimi sa teplotami (20 ° C). Inaktivácia mtgázy je teda ovplyvnená viac teplotou ako tlakom a nasleduje po reakcii prvého rádu (Lauber et al., 2001a). Úplná deaktivácia nastáva pri atmosférickom tlaku po 2 minútach a 80 ° C (Menéndez et al., 2006). Inaktivácia vyvolaná tlakom je založená na degradácii a-helixov v povrchovej oblasti enzýmu, ktorá mení terciárnu štruktúru, čo zase ovplyvňuje väzbu na substrát (Menéndez et al., 2006). Na rozdiel od HEWL sa opätovné skladanie po vysokotlakovom spracovaní javí ako neúplné, pretože pri znížení tlaku pretrváva strata aktivity. 28
75%, T3516 Sigma-Aldrich, Steinheim Thymol 3209,1 Carl Roth, Karlsruhe TPCK ošetrený trypsín z hovädzieho dobytka 10 000 BAEE jednotiek/mg Sigma-Aldrich, bielkovina pankreasu Steinheim, analytické činidlo T1426 kyselina trichlóroctová (TCA) VWR, Darmstadt N-Tris (hydroxymetyl) metylglycín analytickej čistoty Serva Elektrophoresis, čistý Heidelberg (Tricin) trisodný fosfát dodekahydrát, pa VEB Laborchemie, Apolda Tris (hydroxymetyl) aminometán (TRIS) tlmivý roztok, A1379 AppliChem, Darmstadt 30
3 Experimentálna časť 3.1.3 Skúšobné materiály Tabuľka 3-4: Peptidy, bielkoviny a zmesi bielkovín Názov Špecifikácia, katalógové č. Výrobca Lacprodan Alpha-10 (srvátkový proteínový izolát) 45,1% α-laktalbumín 45,9% β-laktoglobulín ARLA Foods Ingredience amba, Viby, Dánsko Aspartyllyzín 94,30% syntéza Dr. M. Hellwig, TU Dresden Glutamylglycín G1970 Bachem lyzozým od slepačieho vajca - biela (HEWL)
70 000 - 96 500 U/mg, 62971 Sigma-Aldrich, Steinheim a-laktalbumín
85% izolácia z izolátu srvátkovej bielkoviny (kapitola 3.4) a-laktalbumín z hovädzieho mlieka> 85% Sigma-Aldrich, Steinheim β-kazeín do Aschaffenburgu (1963) Izolácia Dr. C. Partschefeld, TU Drážďany β-laktoglobulín z hovädzieho mlieka
90% (PAGE) Sigma-Aldrich, Steinheim Tabuľka 3-5: Mikroorganizmy zo zbierky kmeňov Allgemeine Biochemie, Technische Universität Dresden Názov Špecifikácia Farbenie podľa gramu pôvodu Bacillus sphaericus - grampozitívna vzorka pôdy Degussa (Antverpy) Bacillus subtilis - gram pozitívna Süßmuth, University of Hohenheim Es coli TG 1 gram negatívny neznáme Pseudomonas putida ATCC 17390 gram negatívny Inštitút pre mikrobiológiu, Univerzita v Hohenheime Streptococcus lactis B 23/2/1 gram pozitívny neznámy 3.1.4 Softvér Tabuľka 3-6: Použitý softvér Aplikovaná analýza aminokyselín (ASA) Elektroforéza (SDS-PAGE) Meranie fluorescencie (test ThT, ANS), prispôsobenie krivky gélovou permeačnou chromatografiou (GPC), UV spektrum (CD) hmotnostná spektroskopia (ESI-TOF-MS) povrchová hydrofobicita (ANS), program Chromstar 6.3, SCPA GmbH Totallab TL 120 v2006c, Wincats, USA FL Solutions, Hitachi UV/VIS spektrá (červená Kongo) Aspect Plus 1.7 (1993-2000) Eurochrom 2000, verzia 2.05, Knauer, Geräteechnik Berlin J-700 pre okno s Štandardná analýza, verzia 1.35.01, JASCO Corp. a CDPro, metóda CONTIN Počítačom podporovaný zber dát pomocou ChemStation pre LC 3D, Agilent Technologies, Böblingen Evaluation Data Explorer verzia 4.0.0.1, Applied Biosystems, Foster City, USA Tecan i-control TM 33
3 Experimentálna časť Tabuľka 3-9: Koncentračné série pre kalibračné roztoky Koncentrácia Kyselina L-glutámová-yhydroxamát [mm] Kalibračný zásobný roztok [µl] Trisacetátový pufor [µl] UV absorpcia λ = 525 nm 2,5 1000 0 0,742 2,0 800 200 0,578 1,5 600 400 0,441 1,0 400 600 0,295 0,5 200 800 0,146 slepá hodnota 0 1000 - Pre roztok mtgázy (40 U mtgázy/100 ml) približne 50 mg mtgázy v 10 ml 0,2 M Tris - Rozpustený octanový pufor. Kalibrácia 1 ml kalibračného roztoku sa zmiešal s 1 ml zastavovacieho činidla a meral sa oproti slepej hodnote pri vlnovej dĺžke λ = 525 nm (obrázok 3-2). Vždy sa vykonalo dvojité určenie. Obrázok 3-2: Kalibračná čiara: Závislosť absorpcie UV žiarenia pri λ = 525 nm na koncentrácii kyseliny L-glutámovej-y-hydroxamátu 40
3 Experimentálna časť Fotometrické stanovenie 50 ul vodného roztoku vzorky sa pipetovalo s 950 ul NaOH do skúmavky Eppendorf a zmiešalo sa s 500 ul roztoku Lowry. Po 10 minútach inkubácie pri teplote miestnosti sa pridalo 500 ul Folinovho činidla a roztoky sa homogenizovali. Absorpcia sa merala po 2 hodinách inkubácie pri 660 nm v spektrofotometri Ultrospec 1000 (Pharmacia Biotech, Freiburg). Kalibračná čiara bola vytvorená za rovnakých podmienok s koncentráciou 20 až 600 ug proteínu/ml (tabuľka 3-10 a obrázok 3-3). Tabuľka 3-10: Schéma pipetovania na kalibráciu na stanovenie proteínov podľa nízkej koncentrácie HEWL [µg/ml] zásobný roztok HEWL [µl] NaOH [µl] UV absorpcia λ = 660 nm slepá hodnota - 1000 0 20 20 980 0,066 ± 0,003 50 50 950 0,136 ± 0,015 100 100 900 0,250 ± 0,005 300 300 700 0,684 ± 0,060 400 400 600 0,827 ± 0,026 600 600 400 1,146 ± 0,032 Vzorka 50 * 950 - * 50 μl roztoku vzorky zodpovedá zriedeniu 1:20 na základe skúšobného objemu Kalibrácia Obrázok 3 -3: kalibračná čiara, závislosť absorpcie UV žiarenia pri λ = 660 nm na koncentrácii HEWL [µg/ml] 43
3 Experimentálna časť Tabuľka 3-15: Separačný program na stanovenie aminokyselín, lítiový systém Čas [min] Pufr 1 Pufr 2 Pufr 3 Pufr 4 Teplota kolóny v peci [C] 0 85 15 0 0 42 3 85 15 0 0 42 4 79 21 0 0 42 21 43 57 0 0 42 25 43 57 0 0 42 33 0 0 100 0 39 0 0 0 100 40 60 43 0 0 68 32 46 74 63 0 0 68 32 74 Identifikácia a kvantifikácia izopeptidov Závod: Pharmacia LKB Alpha Plus Kolóna: Katiónovo výmenná chromatografická kolóna 190 x 4,6 mm PEEK so živicou 7 μm s 11% sieťovaním Vzorkový pufor: citrát sodný 0,2 N, ph 2,20 Injekčný objem: 20 - 100 μl Eluenty: pozri tabuľku 3-16 Prietok: 20 ml/h Elučný program: pozri tabuľku 3-17 Detekcia: Post-kolónová derivatizácia s ninhydrínom, teplota špirály 135 C, meranie: 570 nm Ninhydrínové činidlo: Sykam, Fürstenfeldbruck Prietok ninhydrínového činidla: 0,18 ml/min Vyhodnotenie: Chromstar 6.3 Tabuľka 3-16: Použité pufre des Sodný systém na stanovenie molarity zloženia tlmivého roztoku Asp_Lys a Glu_Lys citrát sodný 0,2 2,20 1 citrát sodný 0,2 3,16 2 citrát sodný 0,2 4,03 3 citrát sodný s chloridom sodným 1,2 6,14 4 hydroxid sodný 0,4 48
3 Parametre experimentálnej časti Meranie: Režim skenovania: Režim dát: EX WL: EM Začiatok WL: EM Koniec WL: Rýchlosť skenovania: Oneskorenie: EX Štrbina: EM Štrbina: PMT Napätie: Odozva: Vlnová dĺžka Emisia skenovania Fluorescencia 370 nm 400 nm 600 nm 240 nm/min 0 s 5 nm 5 nm 700 V 0,01 s kalibrácia Obrázok 3-4: Fluorescenčné meranie kalibrácie testu ANS s 1900 ul roztoku ANS (250 μm) a 100 ul vzorky, λ ex = 370 nm a λ em = 480 nm, neošetrené HEWL v porovnaní s HEWL po fibrilácii počas 96 hodín (podľa Wang et al., 2009b) pri rôznych koncentráciách, korigovaná slepá hodnota. Mierne zvýšenie signálu, keď sa zvýšila koncentrácia neošetreného HEWL, bolo založené na skutočnosti, že činidlo k dispozícii bolo o niečo viac hydrofóbnych väzbových miest. V prítomnosti fibrilovaného HEWL sa však zistilo významne silnejšie lineárne zvýšenie (obrázok 3-4). 3.7.9.2 Test na prítomnosť kongo červenej Tento test založený na UV/VIS detegoval zvýšenie absorpcie roztoku kongo červenej pri 540 nm v prítomnosti amyloidových fibríl (Wang et al., 2009a). 58
3 Experimentálna časť Zásobný roztok tioflavínu T 100 μm sa pripravil z 1,6 mg tioflavínu T (ThT) v 50 ml PBS pufra. Zásobný roztok sa potom zriedil 1:10 (obj./obj.) PBS pufrom, aby sa získal 10 μm ThT roztok. Postup 80 ul 0,05% roztoku vzorky (v/v) sa zmiešalo s 1920 ul roztoku ThT, homogenizovalo sa a použilo sa priamo na meranie fluorescencie. Pri excitačnej vlnovej dĺžke 440 nm sa na fluorescenčnom spektrofotometri F-4500 zaznamenalo emisné spektrum od 450 do 530 nm. Na matematické vyhodnotenie sa použila fluorescenčná intenzita pri 485 nm Na stanovenie hodnoty slepého pokusu sa namiesto 80 ul roztoku vzorky pridal soľný roztok (pH 2,2, pozri 3,3). Parametre merania: Režim skenovania: Režim údajov: EX WL: EM Začiatok WL: EM Koniec WL: Rýchlosť skenovania: Oneskorenie: EX Štrbina: EM Štrbina: PMT Napätie: Odozva: Vlnová dĺžka Emisia skenovania Fluorescencia 440 nm 450 nm 530 nm 6 nm/min 0 s 5 nm 5 nm 700 V 0,01 s kalibrácia Obrázok 3-6: Kalibrácia testu ThT s 1920 ul roztoku ThT (10 μm) a 80 ul vzorky, λ ex = 440 nm a λ em = 485 nm, Neliečený HEWL v porovnaní s HEWL po fibrilácii počas 96 hodín (podľa Wang et al., 2009b) pri rôznych koncentráciách, slepá hodnota korigovaná 60
4 Výsledky a diskusia o zosieťovaní dosiahli najlepšie výsledky 50 mm pufre s trimérmi v Bis-Tris pufri a stopami tetramérov v systéme Tris. Je tiež mysliteľné, že mierne zvýšený pokles pH pozorovaný v 50 mm pufri Tris-HCl bol prvou indikáciou dobrého zosieťovania. Dôvodom poklesu pH v dôsledku zosieťovania bola skutočnosť, že niektoré bázické aminokyselinové zvyšky po vytvorení izopeptidovej väzby už neboli prístupné rozpúšťadlám. Diskusia o príslušných lyzínových a glutamínových zvyškoch a ich prostredí nasleduje v kapitole 4.2.3. Na základe výsledkov rôznych tlmivých systémov bolo možné zistiť najvyššie zosieťovanie HEWL s mtgázou pre 50 mm-tris-hcl-tlmivý roztok, takže sa zvolilo toto. To znamená, že pomocou tlmivých systémov založených na Tris je možné všeobecne dosiahnuť hodnoty pH 7,2 až 9,0, pretože uvedený tlmivý roztok je stabilný v rámci týchto limitov (Good et al., 1966). Ďalej by mala byť zvolená hodnota ph vhodná pre zamýšľané experimenty. Lyzozým má izoelektrický bod (pí)
37,5 min) a metionín (Met, Rt
43 min) boli takmer základné línie detekované osobitne. V pôvodných HEWL je ich v tomto okamihu 78
4 Výsledky a diskusia Obrázok 4-10: RP-HPLC trypticky štiepenej HEWL: A - neošetrená HEWL; B - HEWL ošetrený mtgázou po dobu 30 minút pri 40 ° C a atmosférickom tlaku; C - HEWL s mtgázou po dobu 30 minút pri 40 ° C a 600 MPa (LMW) Tabuľka 4-8: Identifikácia tryptických peptidov z natívnych HEWL pomocou RP-HPLC s ESI-TOF-MS Špičkový čas [min] m/z tryptický [M + H] + [M + 2H] 2+ peptidy Teoretická hmotnosť peptidu 1 5,1 517,3-69-73 516,27 2 10,3 448,3-126-129 447,23 3 12,8 606,4- 1-5 605,36 4 13,0 874,5 437,7 15-21 873,41 5 13,5 776,4-117-123 775,35 6 14,5 1428,9 714,9 34-45 1427, 64 7 14,7 836,5-6-13 835,39 8 15,1 992,7 496,8 8 6-14 991,49 9 16,5 1045,7 523,3 117-125 1044,53 10 16,9 936,5 468,7 62-68 935,37 11 17,0 1276,7 638,9 115-125 1275,64 12 17,4 1754,6 877,5 46-61 1752,83 13 19, 3 1268,7 634,9 22-33 1267,60 14 19,8 1805,1 902,6 97-112 1802,89 15 20,3 1676,4 838,5 98-112 1674,79 15 20,6 1676, 4 838,5 98 - 112 1674,79 I 15,7 497,3 Neznámy artefakt II 17,75 1288,9 Neznámy artefakt Peptidové vzorce, ktoré sa detegovali pri vlnovej dĺžke 220 nm, nevykazovali u natívneho lyzozýmu žiadne rozdiely (obrázok 4 až 10 A) a HEWL s mtgázou po dobu 30 minút 40 C pri atmosférickom tlaku alebo vysokom hydrostatickom tlaku (obrázok 4-10 B a C). To naznačovalo, že 81 sa používalo na liečbu HEWL
4 Výsledky a diskusia A 1202,2 m/z B 817,5 m/z C 1364,9 m/z 84
4 Výsledky a diskusia D 1010,7 m/z E 1507,0 m/z F 1017,7 m/z Obrázok 4-12: Hmotnostné spektrum šiestich identifikovaných izopeptidových sekvencií (A - F) po tryptickom štiepení v rôznych retenčných časoch (pozri tabuľku) 4-9, ošetrené mtgázou po dobu 30 minút pri 600 MPa a 40 alebo 60 C) a ich izopeptidovými fragmentmi (čísla odkazujú na polohy AA v sekvencii HEWL) 85
4 Výsledky a diskusia o polovici neošetrenej HEWL. Zvyšujúci sa stupeň zosieťovania teda oneskoruje tvorbu jadier (plochý nárast) na jednej strane a rast vlákien (nízka maximálna hodnota) na druhej strane. Skúmanie fibrilačného potenciálu potvrdzuje skôr vyjadrené očakávania druhej teórie (Johnson a kol., 2005 a Booth a kol., 1997) od inhibovanej tendencie k fibrilácii. ABC Obrázok 4-33: Výsledky analýz ANS, Kongo červenej a ThT (A - C) s neošetreným a zosieťovaným HEWL (LMW - 2% HEWL, 40 U mtgázy/g proteínu pri 40 ° C, stupeň zosieťovania: 8,5% a HMW - 3% HEWL, 160 U mtgázy/g proteínu pri 60 ° C, stupeň zosieťovania: 65%) po inkubácii pri pH 2,2, 55 ° C počas 96 hodín. Okrem merania s rôznymi zobrazenými systémami farbív bolo možné vizuálne určiť aj to, že HEWL bol mierne zosieťovaný stav (LMW) sa vyzráža do jemnej, zakalenej zrazeniny, zatiaľ čo neošetrený HEWL vytvára hrubé agregáty (obrázok 4-34). V roztoku vysoko zosieťovaného HEWL (HMW) nebolo viditeľné zrážanie v žiadnom okamihu, napriek mierne sa zvyšujúcim signálom, a pravdepodobne nebola dosiahnutá koncentrácia vlákien potrebná na vyzrážanie. 119
11) je možné dosiahnuť po štyroch cykloch s vákuom alebo bez vákua. 4.6.2 Identifikácia vytvorených izopeptidov Po úspešnom tepelnom zosieťovaní s použitím a bez použitia vákua (ZLCL) by sa mala objasniť otázka použitých izopeptidov. Ako už bolo spomenuté, teoreticky môžu vzniknúť dva rôzne dipeptidy (Simons et al., 2002). Z lyzínu (Lys) a 145