Escherichia coli ako probiotické liečivo z molekulárnych a funkčných liečiv
Escherichia coli ako probiotická aktívna zložka vo farmaceutických výrobkoch Molekulárna a funkčná charakteristika zdraviu prospešných kmeňov DIZERTÁCIA pre získanie akademického titulu Doctor rerum naturalium (Dr. rer.nat.) Fakulty matematiky a prírodných vied Technickej univerzity v Drážďanoch, ktorú predložila Dipl. Biol. Anke Zschüttig narodená 11.11. .1980 v Drážďanoch, predložené 27. apríla 2012
Obsah OBSAH OBSAH. ZOZNAM SKRATIEK. E ZOZNAM OBRÁZKOV. H INDEX TABULIEK. J 1 ÚVOD. 1 1.1 Črevná mikroflóra človeka. 1 1.1.1 Zloženie a funkcia črevnej flóry. 1 1.1.2 Úloha Escherichia coli. 3 1.2 Poruchy črevnej flóry a choroby. 4 1.3 Probiotiká. 6 1.3.1 Definícia, požiadavky, príklady. 6 1.3.2 Účinky a mechanizmy. 7 1.3.3 Oblasti použitia. 9 1.3.4 Mutaflor and Escherichia coli Nissle 1917. 10 1.3.5 Probiotiká od SymbioPharm. 10 1.3.5.1 Produkty od spoločnosti SymbioPharm. 10 1.3.5.2 Symbioflor 2 - zloženie a účinné látky. 11 1.4 Sekvenovanie genómu E. coli. 12 1,5 Antimikrobiálne peptidy od prokaryotov. 13 1.5.1 Definícia a klasifikácia bakteriocínov. 13 1.5.2 Mikrozín. 15 1.5.3 Oblasti použitia - súčasnosť a budúcnosť. 18 1.6 Úloha a cieľ. 20 2 MATERIÁL A METÓDY. 21 2.1 Materiály. 21 2.1.1 Použité chemikálie a spotrebný materiál. 21 2.1.2 Použité súpravy. 21 2.1.3 Pufre a zásobné roztoky. 21 2.1.4 Kultivačné médiá pre množenie baktérií. 22 2.1.5 Antibiotiká. 23 2.1.6 Príslušenstvo pre bunkové kultúry. 23 A
Obsah 2.1.7 Bakteriálne kmene. 24 2.1.8 Plazmidy. 25 2.1.9 Oligonukleotidy. 26 2.1.10 Enzýmy. 27 2.1.11 Softvér. 27 2.2 Metódy. 28 2.2.1 Kultivácia prokaryotických buniek. 28 2.2.1.1 Pestovanie baktérií. 28 2.2.1.2 Chov dobytka. 28 2.2.1.3 Rastové krivky. 28 2.2.2 Kultivácia eukaryotických buniek. 29 2.2.2.1 Bunková kultúra. 29 2.2.2.2 Zmrazenie a rozmrazenie. 29 2.2.3 Kokultivačné experimenty s prokaryotickými a eukaryotickými bunkami. 29 2.2.3.1 Test dodržiavania. 29 2.2.3.2 Test invázie. 31 2.2.3.3 Konfokálna mikroskopia. 32 2.2.3.4 Elektrónová mikroskopia. 32 2.2.3.5 Test inhibičného súdu. 33 2.2.4 Molekulárne biologické metódy. 33 2.2.4.1 Polymerázová reťazová reakcia (PCR). 33 2.2.4.2 Sekvenovanie krátkych úsekov DNA. 35 2.2.4.3 Elektroforéza na agarózovom géle. 36 2.2.4.4 Čistenie DNA. 36 2.2.4.4.1 Čistenie fragmentov DNA. 36 2.2.4.4.2 Čistenie pomocou gélovej extrakcie. 37 2.2.4.4.3 Čistenie sekvenčných reakcií. 37 2.2.4.4.4 Alkoholické zrážky. 37 2.2.4.5 Stanovenie koncentrácie DNA. 38 2.2.4.5.1 Meranie absorpcie. 38 2.2.4.5.2 Stanovenie koncentrácie v agarózovom géli. 38 2.2.4.6 Použitie reštrikčných endonukleáz. 38 2.2.4.7 Defosforylácia. 39 2.2.4.8 Ligácia. 39 2.2.4.9 Výroba kompetentných buniek. 39 2.2.4.10 Elektroporácia. 40 2.2.4.11 Konjugácia. 40 B
Obsah 3.2.3.3 Escherichia coli G3/10 - detekcia antimikrobiálneho peptidu. 86 3.2.4 Detekcia mikrozínu S v Escherichia coli G3/10. 89 3.2.4.1 Analýza kódovania operónov pre Mikrozin S. 89 3.2.4.2 Imunita voči mikrozínu s. 90 3.2.4.3 Skríning prítomnosti génu mcss kódujúceho mikrozín S v Enterobacteriaceae. 92 3.2.4.4 Zistenie baktericídneho účinku mikrozínu s. 92 3.2.4.5 Test inhibičnej zóny. 94 3.2.4.6 Koinfekčné experimenty s enterohemoragickou E. coli. 95 3.2.4.7 Analýza štruktúry a klasifikácie proteínov. 99 4 DISKUSIA. 103 4.1 Symbioflor 2 E. coli - genómová analýza a probiotiká. 103 4.1.1 Genómy Symbioflor 2 E. coli. 104 4.1.2 Probiotický účinok Symbiofloru 2. 105 4.1.3 Bezpečnosť Symbiofloru 2. 106 4.1.4 Porovnanie Escherichia coli G3/10 s Escherichia coli Nissle 1917. 109 4.2 Antimikrobiálne peptidy v Enterobacteriaceae. 111 4.3 Možné použitia mikrozínu s. 113 4.3.1 Potravinársky priemysel. 4.3.2 Mikrozin S - nové antibiotikum. 4.3.3 EHEC - príklad aplikácie. 116 5 ZHRNUTIE/ZHRNUTIE. 119 5.1 Zhrnutie. 119 5.2 Zhrnutie. 120 6 LITERATÚRA. 123 7 PRÍLOHA. 140 PUBLIKÁCIÍ. 172 POĎAKOVANIE. 174 D.
Zoznam skratiek SAP SD SDS Singleton-Gen Sm sp. ssp. ST STEC stx SUE T a TBE TE Tet TNF trna U UE UPEC UV V VTEC ZKBS ZO Štandardná odchýlka krevety alkalickej fosfatázy Gén dodecylsulfátu sodného, ktorý je špecifický pre genóm Druh streptomycínu Poddruh Tepelne stabilný toxín Shiga toxín produkujúci toxíny Shiga toxín Závažné nežiaduce Udalosť Akumulačná teplota Tris-Borate-EDTA Tris-EDTA Tetracyklín Tumor Nekróza Prenos Faktory Ribonukleové kyseliny Nepriaznivé účinky Uropatogénne E. coli Ultrafialový volt E. coli produkujúci verotoxíny Ústredná komisia pre biologickú bezpečnosť Zonula occludens G
Zoznam obrázkov Obrázok 3.31: Skríning génu pre mikrozín H47 mchb v rôznych kmeňoch EHEC. 99 Obrázok 3.32: Aminokyselinová sekvencia prekurzorového proteínu Mikrozin S. 99 Obrázok 3.33: Porovnanie aminokyselinových sekvencií prekurzorových proteínov mikrozínov triedy IIa. 101 Obrázok 4.1: Porovnanie sekvencií v promótorovej oblasti hlycabd operónu E. coli G1/2 a E. coli CFT073. 108 Obrázok 4.2: Štrukturálne komponenty EcN (A) a E. coli G3/10 (B). 110 Obrázok 7.1: BLASTp analýza proteínov McsA (A) a McsB (B). 164 I.
Úvod 1.5.2 Mikrozín Termín mikrozín bol zavedený v roku 1976 (Asensio a Perez-Diaz, 1976) na označenie ribozomálne syntetizovaných antimikrobiálnych peptidov s nízkou molekulovou hmotnosťou 5 kda. Peptidový hlavný reťazec nie je podrobený žiadnej modifikácii. Lineárne polypeptidy majú C-koncový siderofor ako post-translačnú modifikáciu (Vassiliadis et al., 2007). Mikrozíny triedy IIa sú typicky usporiadané do štyroch génov kódovaných na veľkých plazmidoch s nízkym počtom kópií. Patria sem mikrozíny V (MccV, predtým ColV), L (MccL) a 24 (Mcc24). Imunitný proteín je kódovaný v bezprostrednej blízkosti mikrocínu. Okrem toho sa tvoria dva proteíny zapojené do exportu. Transportné proteíny v rámci triedy mikrozinku sú vysoko homologické. Samotné mikrozíny majú charakteristické signálne peptidy. MccV a MccL tvoria disulfidové mostíky. Na rozdiel od všetkých doteraz spomenutých mikrozínov sú mikrozíny triedy IIb chromozomálne kódované. Genetická organizácia je veľmi zložitá. Ako príklad slúži probiotický kmeň E. coli Nissle 1917, ktorý tvorí mikrozíny M (MccM) a H47 (MccH47) (Patzer et al., 2003). Oblasť kódujúca mikrozín obsahuje gény 17
Materiály a metódy psym5 psym6 psym7 psym8 psym9 psym10 psym11 psym12 psym1-st76an Amp R, systém konjugácie pilx, mcss, mcsi, mcsa, mcsb túto prácu túto prácu túto prácu túto prácu túto prácu túto prácu túto prácu túto prácu túto prácu túto prácu túto prácu paz6 Amp R, mcss, mcsi, mcsa, mcsb táto práca paz8 amp R, mcsi, mcsa, mcsb táto práca paz9 cm R, mcss táto práca paz10 cm R, ORF1 táto práca paz11 cm R, ORF2 táto práca paz12 cm R, skrátená mss táto práca paz13 Amp R, mcsi táto práca paz14 Amp R, skrátene mcsi táto práca paz15 Amp R, PBAD, mcss táto práca pgs1 Amp R, PBAD táto práca MCS = Viacnásobné klonovacie miesto; ori TS = teplotne citlivý začiatok replikácie; I-SceI = meganukleáza; FRT = cieľ rozpoznávania flippázy; FLP = flippáza; ORF = otvorený čítací rámec; PBAD = promótor aktivátora arac; Amp = ampicilín; Cm = chloramfenikol; Kana = kanamycín; Tet = tetracyklín. 2.1.9 Oligonukleotidy Zoznam oligonukleotidov použitých spoločnosťou Biomers (Ulm) je uvedený v prílohe v tabuľke 7.1 a tabuľke 7.2. 26
Výsledky 3 VÝSLEDKY 3.1 Analýza bakteriálnych genómov 3.1.1 Genóm Escherichia coli G3/10 Sekvenovanie sa uskutočnilo podľa popisu v časti 2.2.5.1. Genóm E. coli G3/10 pozostáva z 4 935 403 báz. Obsah GC je 50,88%. Automatická a manuálna anotácia identifikovala 4 844 génov, 87 transkriptov trna a 22 transkriptov rrna. Genóm v kruhovej forme je znázornený na obrázku 3.1. Počas anotácie bol každej kódujúcej sekvencii (CDS) priradený názov, takzvaná lokusová značka, názov génu a génový produkt so stručným popisom. Ako základ pre to slúžili analýzy a porovnania BLASTn a BLASTp s položkami v príslušných databázach (Altschul et al., 1990) (zdroje: [5,6]). Rámečky na čítanie boli automaticky anotované a v prípade potreby boli opravené manuálne (pozri 2.2.5.3). Začiatok genómu E. coli G3/10 bol určený génom dnaa. Genóm v súčasnosti pozostáva zo štyroch veľkých častí s tromi medzerami neurčenej sekvencie, ktoré sa nedajú uzavrieť pomocou PCR. Celá sekvencia genómu bude po zverejnení voľne prístupná v databáze (Zschüttig et al., Rukopis v príprave). 51
Výsledky Obrázok 3.1: Kruhové znázornenie genómu E. coli G3/10. Vonkajší krúžok obsahuje mierku v kilobázach (kbp). V druhom kruhu sú gény predného vlákna zobrazené modrou farbou. Na krúžku 3 sú čierne zobrazené gény jadrového genómu, ktoré obsahuje. Krúžok 4 a krúžok 5 ukazujú gény komplementárneho vlákna modrou farbou a gény jadrového genómu čiernou farbou. Dva vnútorné krúžky zobrazujú obsah GC (krúžok 6) a GC zošikmenie (krúžok 7), pomocou ktorých je možné určiť pôvod replikačného oriku a terminus terc. Predné vlákno a komplementárne vlákno obsahuje zhruba rovnaký počet génov (kruh 2 a 5). Gény jadrového genómu (kruhy 3 a 4) sú distribuované cez obe vlákna. Niektoré väčšie oblasti, ktoré neobsahujú gény základného genómu, zodpovedajú genomickým ostrovom a profágovým oblastiam, v ktorých sa obsah GC v niektorých prípadoch významne líši od priemerného obsahu GC v genóme (kruh 6). Často sú spojené s trnami. CDS = kódujúce sekvencie. 52
Výsledky E Obrázok 3.2AE: Kruhové znázornenie genómov E. coli G1/2 (A), E. coli G4/9 (B), E. coli G5 (C), E. coli G6/7 (D) a E. coli G8 (E). Vonkajší krúžok obsahuje mierku v kilobázach (kbp). V druhom kruhu sú gény predného vlákna zobrazené modrou farbou. Na krúžku 3 sú čierne zobrazené gény jadrového genómu, ktoré obsahuje. Krúžok 4 a krúžok 5 ukazujú gény komplementárneho vlákna modrou farbou a gény jadrového genómu čiernou farbou. Dva vnútorné krúžky zobrazujú obsah GC (krúžok 6) a GC zošikmenie (krúžok 7), pomocou ktorých je možné určiť pôvod replikačného oriku a terminus terc. Predné vlákno a komplementárne vlákno obsahuje zhruba rovnaký počet génov (kruh 2 a 5). Gény jadrového genómu (kruhy 3 a 4) sú distribuované cez obe vlákna. Niektoré väčšie oblasti, ktoré neobsahujú gény základného genómu, zodpovedajú genomickým ostrovom a profágovým oblastiam, v ktorých sa obsah GC v niektorých prípadoch významne líši od priemerného obsahu GC v genóme (kruh 6). Často sú spojené s trnami. CDS = kódujúce sekvencie. 56
Výsledky Genomotypy E. coli lokalizované zo Symbioflor 2. EcN sa považuje za obzvlášť prispôsobivý vďaka svojmu nadpriemernému počtu systémov absorpcie železa (Grozdanov et al., 2004). Genomotypy E. coli zo Symbiofloru 2 nesú určité systémy absorpcie železa a používajú ich na získanie konkurenčných výhod. Avšak v týchto E. coli nie je viac systémov absorpcie železa ako v iných porovnateľných kmeňoch E. coli. 3.1.4 Plazmidy Symbioflor 2 E. coli sú divoké typy, ktoré nesú niekoľko prírodných plazmidov. Prehľad všetkých obsiahnutých plazmidov je zobrazený na obrázku 3.6 pomocou obrázka na agarózovom géli. 62 Obrázok 3.6: Plazmidy v divokých druhoch E. coli Symbioflor 2. Číslovanie zodpovedá názvu plazmidu, napr. 3 pre plazmid psym3. * psym1 beží na úrovni genomickej DNA. psym5 a psym6 sú na gélovom obrázku sotva viditeľné a pravdepodobne sú prítomné vo veľmi malom počte kópií. M = veľkostný štandard.
Výsledky Štruktúra krúžku bola uzavretá manuálne. Je pravdepodobné, že budú vo veľmi malom počte kópií. Obrázok 3.7: Megaplazmid psym1 z E. coli G3/10. Plazmid je dlhší ako 40 kb z 99% identický s pmas2027 z uropatogénnej E. coli MS2027 (Ong et al., 2009). Okrem toho sa však vloží asi 10 kb oblasť (označená modrou farbou), do ktorej je zakódovaný mikrozín S novo identifikovaný v tejto práci (pozri 3.2.4). Dva vonkajšie kruhy obsahujú kódujúce sekvencie (CDS) priameho a spätného vlákna. Obsah GC je v treťom zvonení zobrazený čiernou farbou. Krúžok 4 zobrazuje GC-Skew zelenou (+) a fialovou (-). 64
Výsledky ori endo 4000 1800 200 rom/rop 3000 psym2 4197 bps 1000 1400 1600 psym3 1934 bps 400 600 1200 800 2000 1000 csm repa 1200 6000 200 1000 1000 psym4 1304 bps 400 repa 5000 psym5 6567 bps 2000 800 4000 600 3000 ori mobc 10000 4000 8000 psym6 10433 bps 2000 psym7 4452 bps 1000 3000 6000 4000 2000 moba tnpa mobb tnpr mobd Obrázok 3.8: Plazmidové mapy plazmidov obsiahnutých v Symbioflor 2 E. coli s anotáciou kódujúcich sekvencií. 65
Výsledky ORF-3 12000 2000 2000 ORF-1 ORF-1 1500 psym8 2353 bps 500 ORF-2 ORF-4 ORF-5 10 000 8000 psym9 12686 bps 4000 1000 6000 ORF-8 ORF-2 ORF-7 ORF-6 1400 alebo 3000 repa 200 500 1200 psym10 1549 bps 400 2500 psym11 3215 bps 1000 1000 600 2000 800 1500 orit ori mobd/mbkd mobb/mbkb 7000 6000 1000 moba/mbka 5000 psym12 7111 bps 2000 csa mobc/mbkc 4000 3000 oriv csl csi Obrázok 3.8: Plazmové karty plazmidov obsiahnutých v Symbioflor 2 E. coli s anotáciou kódujúcich sekvencií. (Pokračovanie). 66
Obrázok 3.9: Kontrola špecifickosti vyvinutých kmeňovo a skupinovo špecifických PCR pre E. coli G1/2, G6/7 a G8 (A), E. coli G3/10 (B), E. coli G4/9 (C) a E. coli G5 (D). Výsledné pásy sú orámované červenou farbou. Čísla (#) odkazujú na hlavnú zbierku pracovnej skupiny Gunzer. M = štandard veľkosti, NK = negatívna kontrola.
Výsledky Tabuľka 3.5 Prehľad genómov Symbioflor 2 E. coli (k januáru 2012). Genotyp E. coli G1/2 E. coli G3/10 E. coli G4/9 E. coli G5 E. coli G6/7 E. coli G8 Počet plazmidov Odhadovaná dĺžka chromozómu [bp] 1 Odhadovaná dĺžka genómu [bp] 1,2 Číslo Contig 1 Odhadovaný počet génov 2 Počet trna 2 4 748 500 4 757 160 60 4 478 82 22 6 4 935 403 5 010 410 4 4 844 87 22 1 4 514 694 4 515 999 29 4 163 72 22 5 4 578 897 4 603 537 43 4296. 84 22 2 4 978 623 4 987 283 41 4 729 81 22 2 4 873 886 4 882 546 62 4 636 73 22 číslo rrna 1 Hodnoty zodpovedajú kontigom priradeným k dnešnému dňu. 2 Genóm pozostáva z chromozómu a plazmidov. E. coli G4/9 E. coli G5 E. coli G3/10 E. coli G6/7 E. coli G8 E. coli G1/2 Obrázok 3.10: Porovnanie genómu pre E. coli Symbioflor 2 (k januáru 2012). Fylogenetický strom bol generovaný pomocou EDGAR (Blom et al., 2009) a na základe jadrových genómov. 70
Výsledky Obrázok 3.31: Skríning mikrozínu H47 génu mchb v rôznych kmeňoch EHEC. Rôzne kmene EHEC, EcN a E. coli G3/10 sa testovali pomocou primerov mchb_bamhi a mchb_sphi. Gén mikrozínu H47 sa detegoval v kmeňoch EHEC DD, FO1 a FO2. PK = pozitívna kontrola, NK = negatívna kontrola. 3.2.4.7 Analýza štruktúry a klasifikácie proteínov Mikrozín S (MccS) identifikovaný v E. coli G3/10 je proteín 120 AA s vypočítanou molekulovou hmotnosťou 11,67 kda. Termín mikrozín bol zavedený vo vzťahu k malým antibakteriálnym peptidom s molekulovou hmotnosťou