Indukcia ischemickej cievnej mozgovej príhody a ischemicko-reperfúzie u myší pomocou oklúzie strednej tepny

Úvod

Štúdium kardiovaskulárnych chorôb, ako je mŕtvica, je založené na použití modelov in vivo. Aby sme pochopili možné účinky ischémie, toxicity liekov a/alebo liečby, je potrebné použiť vhodný, štandardizovaný, spoľahlivý a reprodukovateľný model choroby, ktorý umožňuje porovnávacie štúdie medzi liečebnými skupinami. V tomto rukopise používame myši kvôli dostupnosti veľkého počtu transgénnych myší a štandardizovaným hodnotiacim modelom. Boli získané skóre škrabania na hodnotenie motorických a behaviorálnych deficitov po experimentálnej ischemickej cievnej mozgovej príhode a po zotavení 1, 2.

K dispozícii je niekoľko modelov ischemickej cievnej mozgovej príhody, ako napríklad úplná globálna cerebrálna ischémia, neúplná globálna ischémia, multifokálna cerebrálna ischémia a fokálna cerebrálna ischémia. Posledná skupina je tiež najčastejšou mozgovou príhodou u pacientov. Väčšina prípadov je iniciovaná tvorbou embolickej alebo trombotickej oklúzie na strednej mozgovej tepne (MCA) alebo v jej blízkosti. Na pozadí týchto parametrov model napodobňuje etiológiu ochorenia ľudskej cievnej mozgovej príhody a robí získané výsledky vysoko relevantnými. 3. Prevod objavov zo zvieracích modelov na liečbu chorôb u ľudí sa však ukázal ako ťažký. Na liečbu akútnej ischemickej cievnej mozgovej príhody bolo zatiaľ schválené iba použitie aktivátora trombolytického tkanivového plazminogénu.

Spomedzi modelov fokálnej cerebrálnej ischémie u myší sú model mozgovej zadnej cirkulácie a model trombózy mozgových žíl veľmi invazívne, čo znižuje ich použiteľnosť a obmedzuje rozsah analýz, ktoré je možné vykonať. Na použitie bez týchto obmedzení sú však k dispozícii aj ďalšie techniky, ako napríklad embolický model, model fototrombózy, model mŕtvice indukovanej endotelínom-1 a model oklúzie cerebrálnej artérie upchatia intraluminálneho stehu (MCAO). Model MCAO je technika opísaná v tomto protokole. Poskytuje spoľahlivú metódu indukcie fokálnej cerebrálnej ischémie, ktorú je možné ľahko reperfúzovať a vykonávať vysoko výkonným spôsobom. K tomuto modelu existujú dva prístupy, a to metódy Zea-Longa a Koizumi. Líšia sa trochu v spôsobe zavádzania oklúzneho stehu do vaskulatúry. V technike Zea Longa sa niť zavádza cez vonkajšiu krčnú tepnu 5. Tu prezentovaná technika je upravená z postupu podľa Koizumiho, pri ktorom je okluzívny steh zavedený cez spoločnú krčnú tepnu 6.

Model MCAO sa úspešne použil na vyhodnotenie rôznych udalostí, ktoré sa vyskytnú počas ischemickej cievnej mozgovej príhody. Po reperfúzii možno pozorovať mozgový edém spolu s rozpadom hematoencefalickej bariéry. Vrcholná neurálna smrť sa zvyčajne pozoruje po 24 hodinách; Na pôvodnú úroveň sa však môže vrátiť po 7 dňoch 7. U ľudí sú pohlavie a vek dôležitými premennými pri určovaní výsledkov mozgovej príhody, čo sa tiež pozorovalo u myší a potkanov 8, 9, 10. Niekoľko publikácií ukazuje model MCAO ktorí využili účinnosť liečby 11, 12, 13, 14.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Všetky postupy boli schválené Výborom pre inštitucionálnu starostlivosť o zvieratá a použitie na univerzite v Miami (IACUC) v súlade s pokynmi Národného inštitútu zdravia (NIH). Vyžaduje sa použitie v sterilnom vybavení a aseptické techniky.

1. Pripravte si oklúziu

  1. Použite steh s priemerom 0,21 mm pre myši medzi 20 až 25 g a 0,23 mm pre myši s telesnou hmotnosťou od 25 do 35 g. Výber typu stehov pre postup MCAO je založený na hmotnosti zvieraťa.
  2. Strieborným perom označte šev začínajúci na 9 mm od hrotu potiahnutého silikónom. To bude slúžiť ako vodítko k dĺžke inštalácie.

2. Príprava na operáciu

3. Disekcia spoločnej krčnej tepny a vnútorné/vonkajšie rozvetvenie

4. Príprava CCA na zavedenie švu MCAO

  1. Pod CCA vložte tri segmenty nylonovej nite o dĺžke asi 4 palce. Uistite sa, že CCA nie je skrútený, pretože by to drasticky sťažilo zavedenie stehu.
  2. V najnižšom možnom bode zviažte dolný šev permanentným uzlom.
  3. Horný šev priviažte tesne pod spojom ICA/ECA pomocou odnímateľného uzla.
  4. Upevnite stredný šev pomocou odnímateľného bežiaceho uzla, ale držte ho dokorán. Je dôležité ponechať dostatok priestoru, pretože to nezabráni zavedeniu švu.
  5. Pomocou mikrodisekčných pružinových nožníc urobte rez v CCA medzi dolným a stredným stehom. Urobte 0,2 mm rez blízko spodného švu.

5. Oklúzia strednej mozgovej tepny

6. Uzatvorenie rezu a pooperačná starostlivosť

  1. Zviera opäť anestetizujte (postupujte podľa pokynov v 2.1) a vyberte stehy na uzavretie rany.
  2. Pomocou klieští a oddeľovačov tkanív rez znovu otvorte a odkryte CCA.
  3. Opatrne odstránite horný šev a jemne zatiahnite za šev MCAO, kým silikónom potiahnutá časť nie je uprostred uzla.
  4. Vyššie uvedený uzol opakujte na stehu, aby ste zabránili pretečeniu krvi cez steh (nemusí to byť uzol, ktorý sa kĺže).
  5. Opatrne uvoľnite stredný uzol a steh pretiahnite za horný uzol, ale udržujte ho v CCA.
  6. Tesne zatvorte tepnu horného uzla, aby ste zabránili prietoku krvi.
  7. Úplne potiahnite šev MCAO a pevne zatvorte stredný uzol.
  8. Steh MCAO je možné opakovane použiť niekoľkokrát. Po každom použití jemne očistite steh pomocou 70% etanolu, aby ste odstránili nečistoty (napr. Krv alebo tkanivo) sterilnou gázou. Potom vložte steh do sterilizačného vrecka a vysterilizujte ho.
  9. Zopakujte kroky 6.1-6.4 a sledujte zotavenie zvierat.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Okrem štúdia objemu cievnej mozgovej príhody je možné vykonať imunofluorescenciu pre rôzne ciele, napríklad pre proteín-2 asociovaný s mikrotubulmi (MAP2) na poškodenie neurónov (3A) alebo gliový fibrilárny kyslý proteín (GFAP) na astrogliózu (3B). Takéto analýzy ďalej umožňujú analýzu progresie a obnovy mozgovej príhody, ako aj ďalších procesov podieľajúcich sa na poškodení a oprave tkaniva mŕtvice.

ischemickej
Obrázok 1: rong> Schematické znázornenie arteriálnej fyziológie mozgu. Postup inzercie MCAO zo spoločnej krčnej tepny (CCA) smerujte do oklúznej oblasti označenej modrou farbou. (:;: Stredný šev; BS: spodný šev MS horný šev TS) Chirurgická oblasť je na dolnom konci postavy (oválny tvar) a umiestnenie švu je označené čiernymi čiarami. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

cievnej
Obrázok 2: TTC - Farbenie častí mozgu. Horný panel predstavuje typické sfarbenie po fingovanej inzercii. Po 60 minútach sledovania MCAO sa získalo 90 minút alebo 24 hodín reperfúznej reakcie na strednej a dolnej doštičke. Stupnica je 1 mm.

3 "src ="/files/ftp_upload/54805/54805fig3.jpg "/>Obrázok 3: Imunofluorescenčné farbenie po mozgovom mŕtvici. Po 60-minútovej oklúzii sa mozgy odoberali 23 hodín a spracovali sa na reperfúzne kryorezanie. S protilátkami proti MAP2 (hore) a GFAP (dole) sa tkanivo analyzovalo na neuronálne poranenia a astroglyózu buď simulované (ľavé polia), alebo 90-minútové ischemicko-reperfúzne mozgy (pravé polia). Prezentované obrázky sú snímané z viacerých obrázkov kombinovaných konfokálnou mikroskopiou s použitím 10-násobného objektívu. Stupnica je 1 mm. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

stôl 1. Meradlo pre posudzovanie myši - Stav a neurodeficit po mozgovej príhode. Upravené z 1, 2.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

V závislosti na skúsenostiach používateľa môže byť táto metóda použitá pri vysokej priepustnosti na vyšetrenie veľkej skupiny zvierat. Štatistická významnosť štúdií na zvieratách závisí od použitia dostatočného počtu subjektov medzi liečebnými skupinami napriek rozpoznaniu vnútorných rozdielov medzi testovanými zvieratami. Predložený protokol umožňuje takéto štúdie a zároveň úzko obnovuje časti chorobného procesu.

Výhodou techniky MCAO je, že aj keď zahŕňa niektoré chirurgické zákroky, nevyžaduje veľmi invazívne zákroky, ako je to v kraniotomickom modeli. Okrem toho je vysoko reprodukovateľný a reperfúzia je vysoko kontrolovateľná, čo nie je možné pri modeloch endotelínu-1 alebo embolickom mŕtvici. Táto technika napodobňuje proces ľudskej ischemickej cievnej mozgovej príhody a produkuje poranenia charakteristické pre tkanivá pozorované u ľudí, čo neplatí pre model fototrombózy. V porovnaní s inými publikovanými technikami nebude postup MCAO vyžadovať kauterizáciu EDA. To je výhoda, pretože sa dá kombinovať s našim infúznym modelom ICA na dodanie terapeutických látok do postihnutej hemisféry po indukcii cievnej mozgovej príhody 23, 24, 25.

Okrem tkanivovej analýzy možno správanie zvierat sledovať pozdĺžne, aby sa vyhodnotila závažnosť mŕtvice a zotavenie. To môže pomôcť porovnať zotavenie medzi rôznymi liečebnými skupinami. Na hodnotenie správania bolo vyvinutých niekoľko prístupov. Na hodnotenie neurologického deficitu po cievnej mozgovej príhode možno použiť jednoduchú 5-bodovú stupnicu (0: žiadny deficit správania; 1: žiadne predĺženie predných labiek kontralaterálne; 2: krúženie na opačnej strane infarktu; 3: pasce na opačnej strane infarktu; 4: Nízka úroveň vedomia a spontánny pohyb) 5. Okrem toho je možné vykonať hĺbkovú analýzu stavu a správania zvieraťa s cieľom vyhodnotiť zotavenie ako 2 v stôl 1 1 popísané.

Predložený chirurgický zákrok využíva mechanický postup na vyvolanie mozgovej príhody, ktorý v štúdiách citlivosti na mozgovú príhodu obmedzuje použitie tejto techniky a/alebo patogénov. Tento protokol však môže byť pozoruhodne užitočný pri analýze závažnosti mozgovej príhody, jej stratégií obchádzania alebo obmedzovania, zhoršujúcich faktorov a možných terapeutických prístupov po mozgovej príhode. Porovnanie medzi liečebnými skupinami môže pomôcť identifikovať potenciálne liečby, ktoré môžu minimalizovať poškodenie mŕtvice alebo urýchliť zotavenie. Pomôcť pacientom s mozgovou príhodou zlepšiť zotavenie by malo skutočne veľký význam.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.