Izolácia a diferenciácia kmeňových buniek derivovaných z tukového tkaniva z podkožného tukového tkaniva ošípaných

Úvod

Obezita, ktorá predstavuje približne 30% populácie USA, s indexom telesnej hmotnosti vyšším ako 30, sa ukázala ako celosvetový fenomén 1. Obezita 2-4 má tendenciu viesť ku komplikáciám súvisiacim s kardiovaskulárnymi chorobami, cukrovkou 2. typu a rakovinou. Dôležitou prioritou je preto obezita, ktorú je možné riešiť. Obezita sa prejavuje masívnym rozširovaním tukového tkaniva a v modernej spoločnosti sa jej pripisuje prejedanie a sedavý životný štýl. Udržanie transkripčnej regulácie adipogenézy a dešifrovania lipogenézy by teda mohlo sľubovať liečbu obezity alebo cukrovky.

3T3-L1, 3T3-F442A a ďalšie myšie adipogénne bunkové línie sa použili na štúdium adipogenézy alebo lipogenézy počas vývoja tukového tkaniva. Existujú však určité odchýlky v regulačných mechanizmoch medzi bunkovými líniami in vitro a in vivo na zvieratách 6. Kmeňové bunky odvodené z primárneho tukového tkaniva (ADSC) vo frakcii vaskulárnych buniek strómy je možné izolovať priamo z bieleho tukového tkaniva a indukovať ich diferenciáciu. Diferenciácia ADSC v adipocytoch s najväčšou pravdepodobnosťou rekapituluje proces adipogenézy a lipogenézy vo vývoji tukového tkaniva in vivo 7.

Ošípané sú vhodným zvieracím modelom na štúdium adipogenézy a lipogenézy vo vývoji tukového tkaniva. Naše predchádzajúce štúdie ošípaných 8 - 10 ukazujú, že expresia sterol - regulačný prvok viažuci transkripčný faktor 1c (SREBP1c), dôležitý transkripčný faktor, o ktorom je známe, že moduluje transkripčnú lipogénnu syntázu mastných kyselín, ktorá je inhibovaná polynenasýtenými mastnými kyselinami (PUFA) v prasacej pečeni a tukovom tkanive. . Expresia prasačieho SREBP1c znížená pomocou PUFA in vivo a in vitro je podobná ako u iných druhov, ako napríklad u ľudí a myší 11-13. Tieto štúdie ošípaných in vitro sa primárne uskutočňujú v diferencovaných adipocytoch pochádzajúcich z prasacieho ADSC (pADSC). Preto môže byť táto primárna bunková kultúra pADSC použitá ako spoľahlivý bunkový systém, ktorý slúži ako vývoj tukového tkaniva alebo na štúdium ďalších aplikácií kmeňových buniek.

Protokol

POZNÁMKA: Táto metóda bola vyrobená a použitá vo výskume, ktorý bol v minulosti publikovaný 14-17 z tohto laboratória; metodika sa časom zmenila. Súčasný postup sa uskutočňoval na prasiatku (vo veku 7 až 9 dní), ktoré sa naočkovalo na 6-jamkové doštičky pre tkanivové kultúry s priemerom 60 g podkožného tukového tkaniva ošípanej. Všetky postupy sa uskutočňovali pri RT, pokiaľ nie je uvedené inak. Všetky experimenty na zvieratách boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat (IACUC) na Národnej taiwanskej univerzite.

1. Pripravte si tráviace médium

  1. Získajte podkožný tuk z krku a chrbta; 40 až 80 g na prasiatko (staré 7 až 9 dní), v závislosti od veľkosti ošípaných. Tu sa použije 60 g podkožného tukového tkaniva získaných z ošípanej.
  2. Pripravte si tráviace médium: odvážte prášok kolagenázy II s celkovým počtom 54 000 jednotiek a rozpustite ho v 90 ml média Eagle modifikovaného Dulbeccom (DMEM, 60 g tuku) v 100 ml sérologickej fľaši (900 jednotiek kolagenázy/1,5 ml DMEM/g tuku). ).
  3. Jemne krúžte na sterilizáciu, aby sa rozpustila najmenej 15 minút, a potom pretiahnite tráviace médium cez 0,22 um filter, aby sa tráviace médium dostalo na trepačku (100 otáčok za minútu). Pred použitím uchovávajte pri 4 ° C.

2. Disekujte subkutánnu tukovú tkanivu z prasaťa

derivovaných
Obrázok 1. Prispôsobený rezací stroj pre the Použitá izolácia pADSC. Rozdelené tukové tkanivo z podkožného tukového tkaniva z bravčového chrbta zložené z tukovej vrstvy s pripojenými vrstvami kože. Na rezanie tukovej vrstvy s hrúbkou asi 1 mm sa vyžaduje rezací stroj, aby sa zabránilo prerazeniu do vrstiev kože. Zľava doprava: držiak podložky, rezačka, rezací kotúč z uhlíkovej ocele a skrutky. Keď je zostavený, krájací nôž vložený medzi držiak plátkov a krájaciu dosku. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

3. Odber pADSC zo stromatovaskulárnej frakcie

  1. Tráviace médium obsahujúce natrávené tukové tkanivo nechajte prejsť cez jednu vrstvu šifónu v čistej sterilizovanej 250 ml Erlenmeyerovej banke alebo 250 ml sérologickej banke. Pomocou klieští stlačte stred šifónu, aby ste viedli a podporili priechod digestívu.
  2. Vypustite a šifón otočte kliešťami, aby bol prechod úplne dokonalý.
  3. Distribuujte tráviace médium do štyroch 50 ml kónických centrifugačných skúmaviek (

4. Identifikácia povrchových markerov kmeňových buniek z pADSC prietokovou cytometriou

5. Diferenciácia pADSC na adipocyty, osteocyty a chondrocyty

6. Farbenie diferencovaných adipocytov, osteocytov a chondrocytov

Reprezentatívne výsledky

PADSC odvodený z dorzálneho podkožného tukového tkaniva ošípaných sa vysial na kultivačné platne alebo misky a umiestnil do 2. Ukázalo sa, že morfológia pADSC z vaskulárnej frakcie strómy je podobná ako pri ADSC pochádzajúcom z myší alebo ľudí. Dvadsaťštyri hodín po nasadení vyhovel subkonfluentný pADSC a mal rozšírenú morfológiu podobnú fibroblastom. (2A). PADSC splýva do 72 hodín a je pripravený na adipocyty alebo inú diferenciáciu mezenchymálneho typu (2 B). pADSC vykazujú po chemickej indukcii silný adipogénny potenciál a zrelé adipocyty sa môžu líšiť po 9 dňoch, pričom viac ako 90% pADSC vykazuje adipogénnu diferenciáciu (Obrázok 2C) byť sledovaný.

Na riešenie vlastností pADSC odhalených v tomto protokole sa povrchové markery pADSC hodnotili pomocou analýzy prietokovou cytometriou. Ako v 3 zobrazené je , Povrchové markery pre mezenchymálne kmeňové bunky vrátane CD29, CD44, CD90 a MHC I (alebo HLA I) boli vysoko exprimované. Negatívne povrchové markery, ako napríklad CD4a, CD31, CD45 a MHC II (alebo HLA II), boli v pADSC odvodenom v protokole ťažko detekovateľné. (Obrázok 3). Tieto výsledky naznačujú, že tieto pADSC vykazujú vlastnosti kmeňových buniek mezenchymálneho typu bez významnej kontaminácie endotelovými alebo hematopoetickými kmeňovými bunkami, vrátane myeloidných alebo lymfatických progenitorov.

Aby sa zabezpečilo, že pADSC predstavujú mezenchymálne kmeňové bunky, bola multipotencia pADSC skúmaná diferenciáciou na adipocyty, osteocyty a chondrocyty. Tieto adipocyty, osteocyty a chondrocyty boli zafarbené špecifickými farbivami, olejovou červenou O, alizarínovou červenou S a respektíve toluidínovou modrou O. (Obrázok 4). Tieto dáta naznačujú, že tento protokol produkoval pADSC, ktoré si zachovali mu-tipotenciu s úplnými vlastnosťami podobnými prekurzorom mezenchymálneho typu.

izolácia
Obrázok 2. Morfológia pADSC z oblasti bravčových bedier. (A) Subconfluent pADSC uviazol a po 24 hodinách naočkovania sa rozšíril na 6-jamkovú kultivačnú platňu. (B) Po 72 hodinách naočkovania sa pADSC spojil na 6-jamkovej kultivačnej doštičke. (C) Zrelé adipocyty boli pozorované po 9 dňoch adipogénnej diferenciácie pomocou pADSC. Fotografie urobené pri 100-násobnom zväčšení boli mikroskopiou s fázovým kontrastom. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

kmeňových
Obrázok 3. Identifikácia kmeňových buniekZnačkovače povrchu pre pADSC. 1 x 105 pADSC bolo implementovaných so špecifickými protilátkami a analyzované na markery kmeňových buniek prietokovou cytometrickou analýzou. Čísla označujú percento zafarbených buniek v populácii (červené) v porovnaní s nefarbenou kontrolou. Os x predstavuje relatívnu intenzitu fluorescencie. Osa y predstavuje populáciu buniek. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

buniek
Obrázok 4. Diferenciácia multipotentného pADSC. Multipotencia pADSC sa určila diferenciáciou pADSC na (A) Stanovené adipocyty, (B) Osteocyty (C) Chondrocyty a zafarbené reprezentatívnymi farbivami, olejovou červenou O, alizarínovou červenou S a respektíve toluidínovou modrou O. Obrázky boli o (A) brané 100 x (B) 200 x a (C) 100x zväčšené pomocou mikroskopu s fázovým kontrastom. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Diskusia

Tu predstavujeme spoľahlivý bunkový systém na štúdium vývoja tukového tkaniva v primárnej bunkovej kultúre pADSC. V porovnaní s inými imortalizovanými bunkovými líniami poskytuje táto metóda pohodlný spôsob izolácie veľkého množstva vysoko kvalitných dospelých mezenchymálnych kmeňových buniek, ktoré sa môžu použiť na štúdium diferenciačných procesov adipocytov alebo iných mezenchymálnych línií súvisiacich s vývojom zvierat in vivo. Kritickým krokom v tomto upravenom protokole je, že môžeme odvodiť pADSC u 7- až 9-denného prasiatka, pretože s malými prasiatkami je ľahké manipulovať v porovnaní so staršími ošípanými a podobne ako u iných druhov. Výnos a multipotencia pADSC klesá, keď sú ošípané staré 21 rokov.

Potenciálne zdroje kmeňových buniek zahŕňajú embryonálne kmeňové bunky (ESC), indukované pluripotentné kmeňové bunky (iPS) a postnatálne dospelé kmeňové bunky. Obmedzenie ADSC, klasifikovaného ako dospelé multipotentné kmeňové bunky, spočíva v tom, že multipotencia dospelých kmeňových buniek v rozdielnej diferenciácii línií je relatívne obmedzená v porovnaní s ESC alebo iPSC. Etické otázky týkajúce sa odvodenia ESC a onkogénnych vlastností iPS však obmedzujú použitie ESC a iPSC 22,23. Z tohto dôvodu sa mnoho vedcov zameralo na dospelé kmeňové bunky so snahou o zlepšenie pluripotencie. Najbežnejšou príčinou dospelých mezenchymálnych kmeňových buniek (MSC), ktorá sa už dlho študovala, sú mezenchymálne kmeňové bunky odvodené z kostnej drene 24. Avšak odber kostnej drene sa považuje za pomerne bolestivý postup. Ďalším problémom je, že výťažok kmeňových buniek z kostnej drene je konečný. Aspiráty kostnej drene priemerne 6 x 106 jadrových buniek na ml a MSC predstavujú iba 0,001 až 0,01% všetkých jadrových buniek. Po zvážení týchto nevýhod sa navrhuje ADSC ako menej rušivý zdroj na získanie 25,26 multipotentných kmeňových buniek.

Poďakovanie

Autori by chceli poďakovať všetkým členom laboratória za podrobnú diskusiu a technickú podporu v tomto protokole. Výskum realizovaný v laboratóriu bol podporený z grantov Ministerstva vedy a techniky (MOST 103-2314-B-002-126 a MOST 102-2313-B-002-026-MY3) a z grantov Aim pre najvyššiu univerzitu -Plan Supported (104R350144) National University, Taiwan.