Kvantifikácia aterosklerózy u myší Protokol (preložený do nemčiny)
Zhrnutie
Myšie modely aterosklerózy sú užitočnými nástrojmi na štúdium patogénnych dráh na molekulárnej úrovni, ale vyžadujú štandardizovanú kvantifikáciu vývoja lézií. Tento protokol popisuje optimalizovanú metódu na stanovenie veľkosti lézie v hlavných artériách vrátane koreňa aorty, aortálneho oblúka a brachiocefalickej artérie.
Abstrakt
Kardiovaskulárne choroby sú hlavnou príčinou úmrtí na svete. Vo väčšine prípadov je základnou príčinou artérioskleróza, ktorá je čiastočne chronickým zápalovým ochorením. Experimentálne štúdie aterosklerózy objasnili úlohu cholesterolu a zápalu v procese choroby. To viedlo k úspešným klinickým skúškam aktívnych farmaceutických zložiek, ktoré znižujú klinické prejavy aterosklerózy. Starostlivé a dobre kontrolované experimenty na myších modeloch ochorenia by mohli ďalej objasniť patogenézu ochorenia, ktorá nie je úplne objasnená. Štandardizovaná analýza lézií je dôležitá na zníženie experimentálnej variability a zvýšenie reprodukovateľnosti. Bežné koncové body v experimentálnej ateroskleróze sú stanovenie veľkosti lézie v aortálnom koreni, aortálnom oblúku a brachiocefalickej artérii. Tento protokol poskytuje technický popis na hodnotenie aterosklerózy na všetkých týchto miestach u jednej myši. Protokol je obzvlášť užitočný, ak je obmedzený materiál, čo sa často stáva pri charakterizácii geneticky modifikovaných zvierat.
Úvod
Kardiovaskulárne choroby sú hlavnou príčinou úmrtí na svete, pričom na každé štvrté úmrtie pripadá ischemická choroba srdca a cievna mozgová príhoda 1. Väčšina prípadov je spôsobená aterosklerózou, chorobou charakterizovanou pomalým hromadením plakov obsahujúcich lipidy so známkami chronického zápalu vo veľkých a stredných tepnách 2. Ochorenie zvyčajne zostáva niekoľko desaťročí bez povšimnutia, kým prasknutie alebo erózia plaku nespôsobí arteriálnu trombózu, ktorá vedie k ischemickému poškodeniu tkaniva.
Normálna tepna pozostáva z intimálnej vrstvy s endotelovými bunkami a riedko distribuovanými bunkami hladkého svalstva, z mediálnej vrstvy s bunkami hladkého svalstva a elastickými lamelami a z okolitej adventívnej vrstvy s voľným spojivovým tkanivom 3. Intímna retencia LDL kompenzuje rozvoj aterosklerózy 4. Hromadenie a modifikácia lipoproteínov vedie k agregácii a uviaznutiu v arteriálnej intime 5. Zápalová reakcia je spôsobená zachytenými a upravenými lipoproteínmi 6. Endotelové bunky začínajú exprimovať adhézne molekuly, ako je VCAM-1, na miestach v arteriálnom strome s turbulentným prietokom krvi, čo vedie k náboru cirkulujúcich monocytov a iných leukocytov7. Infiltrujúce sa monocyty sa diferencujú na makrofágy, ktoré pohlcujú lipidy s následnou premenou na makrofágové penové bunky 8 .
Ateroskleróza bola na myších modeloch študovaná s rastúcou frekvenciou od polovice 80. rokov. C57BL/6 je najbežnejšie používaný inbredný kmeň myší pre tieto štúdie a používa sa ako genetické pozadie pre väčšinu geneticky modifikovaných kmeňov 9. Tento kmeň bol založený v 20. rokoch 20. storočia a jeho genóm bol publikovaný 11. roku 2002. Experimenty na modeloch myší majú niekoľko výhod: kolónie sa rýchlo množia, bývanie je priestorovo nenáročné a kríženie príbuzných zvierat znižuje experimentálnu variabilitu. Tento model umožňuje aj genetické manipulácie, ako napríklad cielené delécie génov a inzerciu transgénov. To viedlo k novému patofyziologickému porozumeniu choroby a novým terapeutickým cieľom 12.
Myši divého typu C57BL/6 sú prirodzene rezistentné na artériosklerózu. Majú väčšinu cirkulujúceho cholesterolu v HDL a zložité aterosklerotické lézie sa nevytvárajú ani pri kŕmení stravou s vysokým obsahom tukov a vysokým obsahom cholesterolu 13. Hypercholesterolemické myši, ako napríklad Apoe -/- na pozadí C57BL/6, sa preto používajú ako experimentálne modely artériosklerózy 14, 15. Nedostatok ApoE zhoršuje absorpciu zvyškových lipoproteínov v pečeni a vážne narušuje metabolizmus lipidov. U myší apoe -/- cirkuluje cholesterol hlavne v časticiach VLDL a u myší sa pri pravidelnej Chowovej diéte vytvárajú zložité aterosklerotické plaky.
Ldlr -/- myši napodobňujú vývoj artériosklerózy u ľudí s familiárnou hypercholesterolémiou 16. Myši Ldlr -/- potrebujú západnú stravu, aby si vytvorili druh 17. Westernové diéty napodobňujúce ľudskú konzumáciu a zvyčajne obsahujú 0,15% cholesterolu. LDL receptor rozpoznáva ApoB100 a ApoE a sprostredkováva absorpciu LDL častíc endocytózou. LDL receptory sú zásadné pre pečeňový klírens LDL z cirkulácie, zatiaľ čo expresia LDL receptora v krvotvorných bunkách neovplyvňuje tento proces. To otvára možnosť transplantácie buniek Ldlr +/+ do kostnej drene u príjemcu hypercholesterolu Ldlr -/- a hodnotenie vývoja artériosklerózy. Chiméry kostnej drene sa široko používajú na štúdium zapojenia krvotvorných buniek do experimentálnej aterosklerózy. Transplantácia kostnej drene by však mohla ovplyvniť veľkosť a zloženie aterosklerotických plakov, čo by interpretáciu výsledkov urobilo nejednoznačnou.
Na štúdium špecifických procesov ochorenia boli vyvinuté rôzne varianty myší Apoe -/- a Ldlr -/- s ďalšími genetickými modifikáciami 18. Príkladom sú ľudské APOB100-transgénne myši Ldlr -/- (HuBL), ktoré nesú celý ľudský gén APOB100 19, 20. U týchto myší sa pri pravidelnom stravovaní vyskytuje hypercholesterolémia a ateroskleróza. Vývoj komplexných aterosklerotických plátov však trvá najmenej šesť mesiacov a kratšie experimentálne protokoly zvyčajne používajú západné diéty 21. Veľká časť plazmatického cholesterolu cirkuluje v LDL časticiach, čo dáva HuBL myšiam ľudskejší dyslipidemický lipoproteínový profil v porovnaní s myšami Apoe -/- a Ldlr -/-. Myši HuBL tiež umožňujú štúdie ľudského ApoB ako autoantigénu 22 .
Na myších modeloch aterosklerózy sa vyvíjajú zložité aterosklerotické plaky so spoločnými znakmi ľudských chorôb. Dosky sú však pomerne odolné voči prasknutiu s následným infarktom myokardu. Aterotrombóza je pri hodnotení 23, 24, 25 dokázaná len sporadicky a je experimentálne náročná. Boli vyvinuté špeciálne modely rozbitia plaku, ale v testovacom poli chýba spoľahlivý a reprodukovateľný model na hodnotenie stabilizátorov plaku.
Kvantifikácia aterosklerózy bola v literatúre opísaná mnohými spôsobmi. Posledné snahy sa snažili štandardizovať experimentálny dizajn, uskutočňovanie a podávanie správ o štúdiách na zvieratách 26. Vyšetrovatelia majú rôzne preferencie a techniky prispôsobené svojim laboratóriám. Väčšina výskumných projektov je tiež jedinečná spôsobom, ktorý si vyžaduje určité zmeny protokolu. Z dôvodu multifaktoriálnej povahy choroby sa optimálna kontrola bude líšiť od projektu k projektu. Miestne podmienky a nedostatok štandardizácie môžu viesť k pozorovaným rozdielom vo vývoji chorôb, čo brzdí pokrok v oblasti výskumu. Rozdiely v experimentálnej variabilite tiež znamenajú, že štatistické výpočty výkonnosti musia byť založené na pilotných štúdiách v miestnych podmienkach.
Kvantifikácia artériosklerózy sa odporúča na viacerých miestach cievneho stromu. Tento protokol popisuje, ako získať zvyšok z aortálneho koreňa, aortálneho oblúka a brachiocefalickej artérie u jednej myši a okrem toho ponechať zvyšok torakoabdominálnej aorty na ďalšiu analýzu. Prípravky na tvár umožňujú rýchlu kvantifikáciu lipidmi nabitých plakov v aortálnom oblúku. Zaťaženie chorobou v brachiocefalickej artérii možno tiež kvantifikovať, keď sú vzorky starostlivo vizualizované. Časovo náročnejší prierez koreňa aorty ponecháva niekoľko úsekov k dispozícii na podrobné posúdenie zloženia plaku.
Protokol
Všetky pokusy na zvieratách si vyžadujú súhlas etických orgánov.
1. Obetovanie myší a mikrodisekcia aorty
2. Analýza tváre aortálnej artérie a brachiocefalickej artérie
3. Kryosekcia koreňa aorty
4. Farbenie olejovou červenou O a kvantifikácia aterosklerózy v koreňoch aorty
Reprezentatívne výsledky
Oil Red O je jasne červené farbivo disazo rozpustné v tukoch, ktoré farbí neutrálne lipidy. Polárne lipidy v bunkových membránach nie sú zafarbené. Farbenie olejovou červenou O je možné vykonať na čerstvých, zmrazených alebo vo formalíne fixovaných vzorkách, ale nie na parafínových vzorkách z dôvodu odstránenia lipidov v požadovanom procese odparafínovania. Kvantifikácia akumulácie lipidov v lézii by sa mohla uskutočniť farebným opuchom olejovo červenej O-pozitívnej oblasti celej oblasti lézie (obrázok 4C)). Hematoxylín produkuje modré škvrny na bunkových jadrách, čo pomáha pri vizualizácii morfológie plakov. Pravá a ľavá koronárna artéria sa všeobecne líšia od aorty o 250 m od aortálneho sínusu 27, čo sa často zhoduje s najvýznamnejšími veľkosťami lézií. Prierezy z tejto oblasti sa často zobrazujú ako reprezentatívne výsledky (obrázok 4D).
Na farbenie aorty pripravenej na tvár by sa mohol použiť olej Red O, ale tento protokol používa Sudan IV, ďalšie vhodné disazo farbivo rozpustné v tukoch. Sudan IV jasne vizualizuje aterosklerotické pláty v oranžovo-červenej farbe farbením lipidov, triglyceridov a lipoproteínov. Odstránenie tmavého pozadia na reprezentatívnych obrázkoch oblúka aorty na tvári by mohlo zlepšiť vizuálne znázornenie (obrázok 5A). Obvykle je veľkosť lézie rozdelená do skupín, čo umožňuje štatistické testovanie pomocou t-testu študenta medzi skupinami. Rozptylový graf, ktorý zobrazuje jednotlivé myši aj priemer v porovnaní medzi skupinami, je informatívnym spôsobom na prezeranie výsledkov (Obrázok 5B-C). Pretože variácie v rámci skupín sa zvyčajne líšia medzi pozíciami vo vaskulárnom strome, sú zvyčajne potrebné samostatné výpočty výkonnosti. Zbytočným odchýlkam sa dá vyhnúť pomocou metodickej spôsobilosti a štandardizácie protokolu. Získanie štatisticky významných výsledkov je dôležité, ale vždy sa musí brať do úvahy biologická významnosť pre pozorovaný rozdiel.
Doplnkový obrázok 1: Alternatívna organizácia snímok pre sériové rezy koreňa aorty. Zjednodušená systematická organizácia snímok na zber rezov z koreňa aorty. Zbierka umožňuje farbenie olejovou červenou O pre lipidy a imunohistochemické alebo imunofluorescenčné farbenie. Špeciálne podložné sklíčka pre sfarbenie kolagénu červenou farbou Picrosirius sú vynechané. Kliknutím sem stiahnete tento súbor.
Diskusia
Zverejnenie
Autori nemajú čo prezradiť.
Poďakovanie
Ďakujeme všetkým bývalým členom experimentálnej kardiovaskulárnej výskumnej jednotky Görana K. Hanssona, ktorí sa za posledné štvrťstoročie podieľali na vývoji tohto protokolu. Sme vďační najmä za príspevky od Antonina Nicolettiho, Xinghua Zhou, Anny-Karin Robertsonovej a Inger Bodinovej. Túto prácu podporili granty na projekty 06816 a Linnaeus 349-2007-8703 od Švédskej rady pre výskum a granty od Švédskej nadácie pre srdce a pľúca, Štokholmskej župnej rady, Nadácie profesorky Nanna Svartzovej, Loo a Hansa Ostermana. Nadácia pre lekársky výskum, Výskumná nadácia Karolinska Institutet a Nadácia pre geriatrické choroby na Karolinska Institutet.