Laborjournal online Journalclub - baktérie na dobrej ceste
Sigrid March
Ilustrácia: iStock/Natallia Yatskova; upravené JM
(12.10.2020) LEIPZIG: Ľudia s obezitou niekedy trpia metabolickými poruchami a cukrovkou 2. typu. Vedci dokázali, že u týchto pacientov sa viac baktérií z čriev dostane do okolitého tukového tkaniva a vyvolá tam zápalové reakcie: čím viac baktérií našli, tým vyššie boli hodnoty zápalu a chorí pacienti.
Viac ako polovica dospelých v Nemecku má nadváhu, takže má index telesnej hmotnosti (BMI) vyšší ako 25 kg/m 2; asi 16 percent má veľkú nadváhu (obezitu; BMI viac ako 30 kg/m 2). Obezita ovplyvňuje vaše zdravie v závislosti od toho, kde sa tuk hromadí. Najmä takzvaný viscerálny tuk, ktorý obklopuje vnútorné orgány v bruchu a chráni ich pred mechanickými vplyvmi, má pri nadmernom príjme potravy tendenciu sa zväčšovať. Tento viscerálny tuk však nie je len tak ležať, vylučuje tiež rôzne hormóny a adipokíny. Patria sem napríklad cytokíny, ako je interleukín-6 (IL-6) a faktor nekrotizujúci nádory (TNF) -α alebo peptidový hormón adiponektín, modulátor inzulínu. Je pochopiteľné, že príliš veľa viscerálneho tuku môže vyvážiť ľudský metabolizmus.
Viscerálna obezita je dobre známym rizikovým faktorom pre množstvo chorôb, napríklad artériosklerózu, rakovinu alebo cukrovku 2. typu. Asi sedem miliónov ľudí v Nemecku žije s diabetes mellitus. Viac ako 95 percent chorých má typ 2, inzulínovú rezistenciu, ktorá sa v starobe často plazí. Pankreas spočiatku naďalej produkuje dostatok inzulínu - na rozdiel od cukrovky 1. typu -, ale cieľový orgán ho už neabsorbuje. To vedie k trvale zvýšenej hladine cukru v krvi, čo zase podporuje poškodenie orgánov a komplikácie ako mŕtvica a infarkt. Najdôležitejšími rizikovými faktormi pre vznik cukrovky 2. typu sú okrem genetickej predispozície a príliš malého pohybu aj nadváha. 90 percent pacientov má nadváhu, štvrtina dokonca obéznych.
Prečo však niektorí obézni ľudia veľmi metabolicky ochorejú a iným nie? To je otázka, ktorú položili vedci z Kliniky a polikliniky pre endokrinológiu, nefrológiu a reumatológiu v lipskej univerzitnej nemocnici, presnejšie vedúci štúdie Peter Kovacs. Je profesorom genetiky obezity a cukrovky v Integrovanom výskumnom a liečebnom centre pre obezitu. Po štúdiu farmácie na Slovensku prišiel Kovacs do Greifswaldu, kde v roku 1998 získal doktorát z genetiky cukrovky 2. typu. Po postdoktorandských rokoch v National Institutes of Health vo Phoenixe (Arizona) skončil v Lipsku. Tam sa stretol s lekárkou Rima Chakaroun. Endokrinologička počas svojej dizertačnej práce pracovala na adipokínoch a neskôr zahájila štúdiu o účinku črevného mikrobiómu na obezitu a metabolické ochorenia.
To znie ako optimálna kombinácia na preskúmanie súvislosti medzi obezitou a cukrovkou 2. typu. Vedci zistili, že je obzvlášť zarážajúce, že v tukovom tkanive mnohých obéznych ľudí boli pozorované zápalové procesy. „Ako súčasť stravy s vysokým obsahom tukov kŕmili ďalší vedci myši jedlom, ktoré obsahovalo fluorescenčne označené baktérie. Neskôr našli fragmenty týchto baktérií v tukovom tkanive, “uvádza Chakaroun. Boli to baktérie, ktoré spôsobili zápal? "Takže sme začali hľadať baktérie v ľudskom tukovom tkanive," hovorí Kovacs. Výsledkom bola publikácia v Gute, ktorej autormi boli Chakaroun a (vtedy ešte) doktorand Lucas Massier (69: 1796-806).
Pre túto štúdiu lipskí vedci prijali 75 pacientov (priemerný BMI 48 kg/m 2), ktorí podstúpili bariatrickú chirurgiu. Operácia žalúdočného bypassu Roux-en-Y je typom zmenšenia a skrátenia tenkého čreva v žalúdku. Jedlo vedie obchvatom cez tráviaci trakt. To by malo ľuďom pomôcť pri znižovaní hmotnosti, okrem iného aj preto, že jedlo nie je úplne absorbované. 33 z testovaných osôb boli tiež pacienti s cukrovkou 2. typu s významne zvýšenými parametrami zápalu a abnormálnymi hodnotami metabolizmu glukózy v krvi.
Počas zákroku chirurgovia odobrali vzorky subkutánneho a viscerálneho tuku - čo najsterilnejšie - z rôznych miest, ako napríklad omentum (sieťovitá štruktúra na pobrušnici) alebo mezenterium (časť suspenzie čreva). Z týchto vzoriek tkaniva izolovali Massier, Chakaroun a kolegovia DNA a RNA a vytvorili tkanivové rezy.
Vedci v skutočnosti našli bakteriálnu DNA v tukovom tkanive, aj keď v extrémne malom množstve. Iba 0,1 až 0,5 pikogramu na mikrogram celkovej DNA nepochádzalo od ľudí, ale z baktérií. Počas sekvenovania bakteriálneho génu 16S rRNA vo vzorkách tkaniva potom našli veľké množstvo stôp. Niektoré možno vylúčiť ako kontamináciu pomocou bioinformatických algoritmov, ale pacienti s cukrovkou alebo bez nej sa líšili u 18 bakteriálnych druhov. Vedci tento jav nazvali taxonomickým bakteriálnym podpisom špecifickým pre tkanivá, ktorý tiež koreloval s výskytom zápalových markerov a metabolických parametrov.
Peter Kovacs, Rima Chakaroun a Lucas Massier vyriešili záhadu, prečo je tukové tkanivo mnohých obéznych ľudí zapálené. Foto: Universitätsmedizin Leipzig (vľavo); Súkromné (stredné a pravé)
Obe skupiny pacientov mali tiež baktérie kmeňov Proteobacteria a Firmicutes v tukovom tkanive a systémovo. Je známe, že najmä baktérie kmeňa firmicutes sa vyskytujú v črevnom mikrobióme obéznych ľudí častejšie ako je priemer. „Vieme, že určité baktérie v črevnom mikrobióme podporujú priberanie na váhe a že zloženie mikrobiómu závisí od génov aj od nášho životného štýlu,“ hovorí Chakaroun. Vedcov preto neprekvapilo, že narazili na tieto bakteriálne kmene. Výsledky nedokázali zodpovedať, či mikróby skutočne migrujú cez črevnú stenu do okolitého tkaniva alebo či sú absorbované pasívne - takpovediac ako bunkový odpad.
Preto výskumníkom v Lipsku nestačilo hľadať fragmenty bakteriálnej DNA v ľudskom tukovom tkanive. Chceli ukázať, že v bruchu mimo čreva sú skutočne neporušené baktérie. K tomu sa uchýlili k metóde, ktorá sa skutočne používa pri analýze životného prostredia. „CARD-FISH je výrazne citlivejšia ako samotná FISH a dúfali sme, že dokážeme týmto spôsobom detekovať malé množstvá baktérií v tukovom tkanive,“ hovorí Kovacs a dodáva Chakaroun: „Pretože nie sme odborníkmi na mikróby, máme tieto testy spolu vyrobené s Niculinou Musat z Centra pre výskum životného prostredia (UFZ) tu v Lipsku. “
Čo je to CARD-FISH? FISH poznáme ako fluorescenčnú in situ hybridizáciu, to znamená hybridizačnú metódu, pri ktorej sa používajú fluorescenčne označené nukleotidové sondy na lov napríklad komplementárnej DNA alebo RNA na tkanivových rezoch. V mnohých vzorkách životného prostredia nie sú len malé zhluky baktérií, sú tiež dobre distribuované v akomkoľvek množstve nečistôt. To znamená, že signály pozadia sú často výrazne väčšie ako skutočný fluorescenčný signál zo sondy. Aby sme to obišli, k FISH sa teraz pripája CARD, Catalysed Reporter Deposition: klasický tkanivový rez pre imunohistochémiu je hybridizovaný s jednovláknovou sondou DNA proti eubaktériám. Táto sonda neprenáša fluorofor, ale enzým HRP (chrenová peroxidáza). V prítomnosti peroxidu vodíka premieňa peroxidáza neaktívne fluorescenčne označené tyramidy na tyramidové radikály. Tieto sa následne kovalentne viažu na aromatické bočné reťazce proteínov - napríklad tyrozínu - v bezprostrednej blízkosti HRP. Pretože tento proces je enzymatický, mnoho tyramidov sa časom „radikalizuje“.
Namiesto jedného fluoroforu na sondu prijíma výskumník až 1 000 fluorescenčných signálov so zosilnením tyramidového signálu (TSA). Takto upútajú pozornosť aj tie najmenšie stopy bakteriálneho materiálu. Pomocou karty CARD-FISH je možné detegovať a kvantifikovať baktérie bez toho, aby ste ich predtým museli odstrániť alebo obohatiť. A to je presne to, čo lipskí vedci dosiahli - v ľudskom tukovom tkanive našli neporušené baktérie. Ukázali tiež, že čím viac baktérií v tukovom tkanive, tým vyššie úrovne zápalu a chorí pacienti. Záver, ktorý Chakaroun a Kovacs čerpajú z týchto výsledkov: množstvo a zloženie baktérií v tukovom tkanive tiež prispieva k zápalu u pacientov s cukrovkou 2. typu a ľudí s nadváhou.
Nie je jasné, ako presne sa baktérie dostanú do viscerálneho tuku. „Črevo je jedným z najväčších rozhraní s našim prostredím,“ hovorí Chakaroun. „Je známe, že určité stravovacie návyky alebo konzumácia alkoholu ovplyvňujú črevnú priepustnosť.“ Okrem toho niektoré baktérie - napríklad Enterobacteriaceae - produkujú toxické lipopolysacharidy, ktoré tiež zvyšujú priepustnosť črevnej steny. Takto by baktérie v črevnej flóre mohli ľahko migrovať do okolitého tkaniva alebo by ich mohli odplaviť. „V ďalšom projekte budeme merať črevnú priepustnosť pacientov, aby sme mohli dokázať aj tento bod,“ hovorí Kovacs.
Je však naozaj málo baktérií v tukovom tkanive na to, aby vyvolali imunitnú reakciu a ochoreli na ľudí? Vedci nakoniec vypočítali, že malé množstvo bakteriálnej DNA v tukovom tkanive je zhruba ekvivalentné jednej baktérii na každých 100 adipocytov. Preto v modeli bunkovej kultúry otravovali adipocyty porovnateľným množstvom bakteriálnej DNA. A hľa - bunky reagovali búrkou rozhorčenia a - v závislosti od koncentrácie - uvoľnili zápalové markery IL-6 a TNFα.
Vedci z Lipska plánujú v budúcnosti preskúmať viac vzoriek tkaniva. „Chceme pre tento projekt vytvoriť akúsi biobanku, v ktorej sú samozrejme uložené orgánové kontroly zdravých osôb a osôb s normálnou hmotnosťou,“ hovorí Kovacs. Doteraz sa to nepodarilo z dôvodu etických obáv. S klinikou sa však vedú diskusie o spôsoboch, ako bude stále možné získať prístup k zdravému tkanivu.
Spoluautor štúdie Lucas Massier sa však nateraz už nebude zúčastňovať na následných experimentoch. „Táto štúdia zvýšila jeho trhovú hodnotu, a preto bol predtým, ako obhájil dizertačnú prácu, prijatý na Karolinský inštitút v Štokholme,“ hovorí Kovacs. Ale aj tam pokračuje v práci na biológii tukového tkaniva.
Posledné zmeny: 10/12/2020