Lekárske a vedecké aspekty; DRZE

Stav: december 2020
Kontaktná osoba: Aurélie Halsband

lekárske

1. Lekárske a vedecké aspekty

U mnohých živých bytostí dochádza k sexuálnej (sexuálnej) reprodukcii prostredníctvom tvorby a rekombinácie zárodočných buniek (spermie a vajíčka). Kombinácia otcovských a materských génov vytvára nový genóm. Naproti tomu klonovanie je forma nepohlavného alebo vegetatívneho rozmnožovania, pri ktorej je duplikovaný genóm zodpovedajúceho organizmu. Nejde o nijaké preskupenie (rekombináciu) génov, ale vytvorí sa geneticky takmer, ak je to potrebné úplne identická „kópia“ originálu. U mnohých nižších živočíchov a väčšiny rastlín je klonovanie okrem pohlavného rozmnožovania aj bežnou formou reprodukcie. Rovnaká viacnásobná formácia vo forme identických dvojčiat (tvorba monozygotných dvojčiat) sa tiež prirodzene vyskytuje u ľudí, ale iba v rámci sexuálnej reprodukcie.

V laboratóriu je možné organizmy umelo klonovať rôznymi spôsobmi: B. rozdelením už existujúceho embrya, d. H. štiepením embryí alebo vytvorením embrya pomocou prenosu bunkových jadier. Ďalšia metóda je známa z vytvárania takzvaných transgénnych myší, doplňovania tetraploidných embryí (pozri modul Doplňovanie tetraploidných embryí). Okrem rozdielov v technike klonovania je potrebné rozlišovať medzi rôznymi cieľmi klonovania, a to výskumným alebo terapeutickým klonovaním na jednej strane a reprodukčným klonovaním na druhej strane. Všetky techniky klonovania majú spoločný cieľ, a to vytvorenie geneticky identického duplikátu: fragmentu alebo molekuly DNA, bunky, tkaniva alebo, ako v prípade reprodukčného klonovania, celého organizmu.

Predmetom tohto zamerania je klonovanie na výskumné účely alebo terapeutické klonovanie. Reprodukčné klonovanie (pozri modul Reprodukčné klonovanie), t.j. H. použitie technológie na reprodukčné účely sa zohľadňuje, iba ak sú technológie do určitej miery totožné.

Aby sa zabránilo možným nedorozumeniam, je termín „terapeutické klonovanie“, ktorý prevláda vo verejnej diskusii, v nasledujúcom texte nahradený alebo doplnený výrazom klonovanie vo výskume. Väčšina súčasného výskumu nie je zameraná na konkrétne terapeutické projekty, ale je zameraná na oblasť základného výskumu. Tento základný výskum môže a mal by viesť z dlhodobého hľadiska k vývoju nových terapií, ale predovšetkým slúži na základné pochopenie vedecky relevantných procesov.

Čo je to výskumné klonovanie alebo terapeutické klonovanie?

Pod pojmom výskumné klonovanie alebo terapeutické klonovanie sú zhrnuté rôzne metódy: prenos bunkových jadier, preprogramovanie diferencovaných buniek a štiepenie embryí.

Pri metóde nukleárneho prenosu somatických buniek (SCNT) (pozri modul bunkového nukleárneho prenosu) sa jadro akejkoľvek bunky tela vloží do vaječnej bunky, ktorá bola predtým enukleovaná. Bunkové jadro je možné izolovať prakticky z každej dospelej bunky tela darcu. Vajcová bunka získaná z vaječníkov darcu punkciou po špeciálnej hormonálnej liečbe sa enukleuje odsatím jadra mikropipetou a nahradením jadrom, ktoré bolo odsaté z bunky tela. Nové jadro bunky sa prenáša injekciou do cytoplazmy vaječných buniek. Presný spôsob pôsobenia impulzov vychádzajúcich z vaječnej bunky, ktorý ešte nebol úplne pochopený, vedie k preprogramovaniu bunkového jadra, čo vedie k strate špecializácie. Z už diferencovaného stavu sa tak bunkové jadro vráti do stavu, ktorý umožňuje vývoj embrya.

Pokiaľ ide o genetický materiál obsiahnutý v bunkovom jadre, klonované embryo je geneticky identické s darcom bunkového jadra. Samotné mitochondrie, d. H. bunkové komponenty, ktoré sa používajú na generovanie energie v bunke, pochádzajú z vaječnej bunky. Klon, ktorý sa vyvinie po prenose bunkového jadra, je geneticky takmer úplne totožný s darcom preneseného bunkového jadra. Úplná identita sa dosiahne, iba ak sú jadro a darca vajíčka geneticky identické.

Proces prenosu bunkových jadier sa stal známym z výsledkov výskumu tímu vedeného Ianom Wilmutom. V roku 1997 sa mu prvýkrát podarilo vytvoriť embryo cicavca prenosom jadra dospelej somatickej bunky do enukleovanej vaječnej bunky a jeho úplným vývojom. Od tej doby „klonovaná ovca Dolly“ stojí za úspechom výskumu, ale aj za možnosť použitia technológie na reprodukčné účely, ktorá je z etického hľadiska mimoriadne kontroverzná.

Okrem toho je už niekoľko rokov známa metóda, pomocou ktorej je možné úspešne preprogramovať ľudské somatické bunky (pozri modul Preprogramovanie buniek) tak, aby mali vlastnosti embryonálnych kmeňových buniek. Takéto bunky sa nazývajú indukované pluripotentné kmeňové bunky (bunky iPS). Pretože iPS bunky sú tiež geneticky identické s bunkami darcu, sľubuje táto technika eticky a právne menej problematickú alternatívu k terapeutickému klonovaniu. To, či sa iPS bunky môžu za podmienok bunkovej kultúry transformovať aj na totipotentné bunky, je kontroverzné. Úspešná demonštrácia pluripotencie iPS buniek u myší pomocou metódy komplementácie tetraploidných embryí (pozri modul Tetraploidná komplementácia embryí) dáva v tejto súvislosti priestor na diskusiu. Vzhľadom na tieto výsledky je otázne, či by sa proces preprogramovania buniek mal posunúť bližšie k výskumnému klonovaniu alebo výskumu darovaných a umelo generovaných embryí v zmysle jeho etického posúdenia.

Z technického hľadiska sa výskum klonovania a klonovania na reprodukčné účely (pozri modul Reprodukčné klonovanie) zásadne nelíšia. Je však nevyhnutné, aby v prípade výskumného klonovania nebolo embryo umiestnené do maternice, aby mohla porodiť. Skôr sa ničí v ranom štádiu embryonálneho vývoja (štádium blastocysty (pozri štádium modulu blastocysty)), aby bolo možné extrahovať embryonálne kmeňové bunky (bunky ES), ktoré je možné in vitro diferencovať na určité typy buniek. Tento prístup nie je nevhodne označený ako „terapeutické klonovanie“, pokiaľ existuje nádej, že bude konečne schopný preniesť bunky, ktoré boli pre darcovský organizmus k dispozícii na terapeutické účely. V súčasnosti sa však klonovanie väčšinou vykonáva na výskumné účely, kde je to zákonom povolené.

Ďalším spôsobom vytvárania geneticky identického klonu je takzvané štiepenie embryí (pozri modul Štiepenie embryí). Tu sa umelo dosahuje mikrochirurgickým delením embrya dvojčatá alebo viacnásobná formácia. Pretože bunky sú na začiatku embryonálneho vývoja stále totipotentné, vytvárajú sa dve alebo viac embryí, ktoré sa vyvíjajú vo vhodnom prostredí ako nerozdelené embryo. Táto metóda v súčasnosti zohráva vo vzťahu k oblasti výskumného klonovania podradnú úlohu.

Na čo sa používa výskumné klonovanie alebo terapeutické klonovanie?

Primárnym cieľom výskumného klonovania alebo terapeutického klonovania je extrakcia embryonálnych kmeňových buniek (ES buniek) (pozri modul extrakcia ľudských embryonálnych kmeňových buniek). Tieto bunky sú zaujímavé pre výskum, pretože za správnych podmienok sa môžu vyvinúť takmer do všetkých rôznych typov buniek tela. Táto schopnosť sa nazýva pluripotencia (pozri modul Pluripotencia a Totipotencia). Je kontroverzné, či sa kmeňové bunky generované klonovaním môžu tiež transformovať na totipotentné bunky v podmienkach bunkovej kultúry. Experimentálny dôkaz totipotencie (pozri pluripotenciu a totipotenciu modulu) embryonálnych kmeňových buniek je z morálnych dôvodov zakázaný, pretože by bolo potrebné umožniť dozretie celého organizmu.

Bunky iPS, ktoré sú geneticky identické s bunkami darcu, sa tiež považujú za ďalšie obľúbené látky pre spomenuté výskumné ciele. Postup je však v súčasnosti stále spojený s rizikami, ktoré je potrebné pred použitím v terapeutických postupoch vylúčiť. Ukázalo sa tiež, že existujú väčšie rozdiely medzi iPS bunkami a pluripotentnými ES bunkami, ako sa pôvodne predpokladalo. Terapia tkanivovými bunkami získanými z preprogramovaných buniek preto nie je v tomto okamihu možná. Ďalšie podrobnosti možno nájsť v zameraní na výskum kmeňových buniek.

stav výskumu

Dlhodobo prebiehali experimenty v oblasti výskumného klonovania výlučne v pokusoch na zvieratách. V roku 2000 Munsie a kol. po prvýkrát o úspešnej kultivácii pluripotentných embryonálnych kmeňových buniek u myší. Za týmto účelom injikovali bunkám myších vaječných buniek s obsahom jadra genetický materiál z buniek tela myší a takto vytvorenému klonu umožnili dozrieť do blastocysty. Embryonálne kmeňové bunky odstránené z blastocytov sa mohli ďalej kultivovať v Petriho miske a diferencovať na nervové a svalové bunky. Tieto kmeňové bunky sa potom označili a injikovali do myších embryí a tiež do dospelých myší. Bolo možné dokázať, že klonované kmeňové bunky v myšom embryu (pozri modul Kmeňové bunky v myšom embryu) prispievajú k vývoju mozgu, pečene, pľúc, obličiek a ďalších orgánov a môžu sa tiež vyvinúť do rôznych typov tkanív u dospelých myší.

Úspešná extrakcia kmeňových buniek z predtým klonovaných embryí primátov (pozri modul klonovania embryí primátov) bola prvýkrát popísaná na konci roku 2007. Na tento účel sa bunkové jadrá z kožných buniek opíc rhesus preniesli do enukleovaných vaječných buniek prenosom bunkových jadier. Z nich sa vyvinuli blastocysty, z ktorých sa získali kmeňové bunky, ktoré sa preukázali geneticky do značnej miery totožné s pôvodnými bunkami darcu. Vo všetkých testovaných bodoch bunky zodpovedali konvenčným embryonálnym kmeňovým bunkám a podľa výskumnej skupiny vedenej Shoukhratom Mitalipovom sa mohli diferencovať na srdcové svaly a nervové bunky.

Na začiatku roku 2008 Tabar a kol. výsledky terapeutického experimentu s kmeňovými bunkami z klonovaných embryí na liečbu Parkinsonovej choroby na myšom modeli (pozri modul Parkinsonova choroba na myšom modeli). Embryá sa klonovali z kožných buniek myší trpiacich Parkinsonovou chorobou, z ktorých sa odobrali kmeňové bunky, ktoré sa potom dali diferencovať na špecifické nervové bunky. Tieto nervové bunky boli injikované chorým myšiam darcu, ktoré potom nevykazovali žiadne imunitné reakcie, ale významné zmiernenie ich symptómov choroby. Možnosť prenosu výsledkov tohto pokusu na zvieratách na človeka je neistá.

Začiatkom roku 2008 tiež americká výskumná skupina pod vedením Andrewa Frencha po prvý raz zverejnila úspešné klonovanie ľudských embryí (pozri modul klonovanie ľudských embryí). Jadro bolo odstránené z ľudských dospelých kožných buniek a prenesené do enukleovaných vaječných buniek. Na experiment použili vedci 29 vaječných buniek od troch 20- až 24-ročných darcov. Vajcové bunky, ktoré sa stali nadbytočnými počas liečby IVF, boli darované ženami dobrovoľne a bezplatne. Blastocysty sa vyvinuli z piatich vaječných buniek s cudzím genetickým materiálom, ktorého ďalší vývoj vedci prerušili. Úspešné klonovanie jednej z blastocytov, t. J. Genetická identita kmeňových bunkových línií a darcovských buniek, by sa dalo spoľahlivo preukázať.

V máji 2013 sa výskumnej skupine pod vedením Masahita Tachibanu a Shoukhrata Mitalipova podarilo prvýkrát získať ľudské embryonálne kmeňové bunky z klonovaných embryí. Vedci tiež preniesli jadro dospelých kožných buniek človeka do enukleovaných darcovských vaječných buniek. Na štúdium bolo potrebných iba niekoľko vajíčok, pretože vedci dokázali pomocou systematicky vylepšenej metódy zabrániť predčasnému odumretiu embryí. Po niekoľkých bunkových deleniach boli embryá zničené, aby sa z nich získali embryonálne kmeňové bunky.

V apríli 2014 Robert Lanza z biotechnologickej spoločnosti ACT a Dong Ryul Lee z Inštitútu kmeňových buniek v Soule zverejnili úspešné zavedenie línií kmeňových buniek z klonovacieho postupu s diferencovanými dospelými bunkami (pozri modul Klonovací postup s diferencovanými dospelými bunkami). Získali ich z kožných buniek dvoch mužov, ktorí mali 35, respektíve 75 rokov. V porovnaní s predchádzajúcim rokom tak bolo možné preukázať, že kmeňové bunky je možné získať aj z bunkového materiálu, ktorý už vykazuje početné genetické a biochemické zmeny a pravdepodobne poškodenie DNA.

Zastrešujúcim cieľom základného výskumu v oblasti terapeutického klonovania je zníženie účinnosti technológie prenosu jadra (pozri výskum modulov o jadre) a počtu iPS buniek (pozri výskum modulu IPS), ktoré je možné získať preprogramovaním zvýšiť.

Tvorba hybridov človeka a zvieraťa alebo chiméry človeka a zvieraťa je oblasťou doplňujúcou výskumnú oblasť. Proces získavania vajíčok (pozri modul získavanie vajíčok) je spojený s podávaním vysokých dávok hormónov a rizikami spojenými s hľadaním vajíčok. S cieľom obísť problémy spojené s používaním ľudských vaječných buniek sa hľadajú alternatívne zdroje vaječných buniek. Začiatkom roku 2008 britský výskumný tím pod vedením výskumníka kmeňových buniek Lyle Armstrong uviedol, že vytvorili embryá z ľudského genómu a vaječné bunky z kráv po prvýkrát. Cieľom experimentov je okrem iného zistiť, či je možné na kultiváciu a diferenciáciu kmeňových buniek použiť namiesto ľudských vaječných buniek a embryí živočíšne.

Odvtedy pokračujú experimenty na embryách s bunkami živočíšneho a ľudského pôvodu, ktoré sú často kritizované. Novšie štúdie už nie sú zamerané na použitie živočíšnych vaječných buniek, ale skôr na odber ľudského tkaniva, v lepšom prípade celých orgánov zo zvieracích embryí, v ktorých sa predpokladá, že sa ľudské kmeňové bunky budú ďalej vyvíjať in vivo. Predtým sú zvieracie embryá geneticky modifikované takým spôsobom, že ich genetická sekvencia zodpovedná za tvorbu určitých orgánov je „deaktivovaná“. Na ich miesto sa zavedené ľudské indukované pluripotentné kmeňové bunky (bunky iPS) integrujú a v najlepšom prípade tvoria príslušný orgán na základe ľudských buniek.