Meranie bazálnej a forskolínom stimulovanej lipolýzy v protokole inguinálnych tukových tukov

Zhrnutie

Tento protokol popisuje metódu na stanovenie bazálnej a forskolínom stimulovanej lipolýzy v inguinálnych tukových vankúšikoch získaných z normálnej Chow stravy (NCD) alebo z potravy s vysokým obsahom tuku (HFD) ± kapsaicínom kŕmené myši divého typu. Uvoľňovanie glycerínu z inguinálnych tukových vankúšikov sa meralo ako index lipolýzy.

bazálnej

Abstrakt

Lipolýza je proces, pri ktorom sa lipid uložený ako triglyceridy v tukových tkanivách hydrolyzuje na glycerol a mastné kyseliny. Tento článok popisuje metódu merania bazálnej a forskolínom (FSK) stimulovanej lipolýzy v inguinálnych tukových vankúšikoch izolovaných z myší divokého typu buď s normálnou stravou (NCD), s vysokým obsahom tukov (HFD), alebo s vysokým obsahom tukov s 0 01% des kapsaicín (CAP; agonista vaniloidnej podrodiny 1 (TRPV1) s prechodným receptorovým potenciálom) sa kŕmilo 32 týždňov. Metóda opísaná na uskutočnenie ex vivo lipolýzy je používaná Schweigerom a kol. 1 Predstavujeme podrobný protokol na meranie hladín glycerolu UV-viditeľnou (UV/VIS) spektrofotometriou. Tu opísanú metódu je možné použiť na úspešnú izoláciu ingvinálnych tukových vankúšikov na meranie lipolýzy a získať tak konzistentné výsledky. Protokol opísaný pre inguinálne tukové vankúšiky sa dá ľahko rozšíriť na meranie lipolýzy v iných tkanivách.

Úvod

Tukové tkanivá ukladajú energiu ako tuk 2 a na termogenézu 3, 4 je potrebná oxidácia mastných kyselín. Mastné kyseliny, ktoré sa konzumujú stravou, sú zabalené v chylomikrónoch spolu s apoproteínmi a krvou sa uvoľňujú do rôznych tkanív v tele. Aj keď väčšina buniek v tele ukladá rezervu energie, tukové tkanivo ukladá prebytočnú energiu ako tuk 5, 6. Lipolýza v tukovom tkanive je regulovaná zložitými procesmi a molekulárne podrobnosti lipolýzy zostávajú neurčité 7 .

Lipolýza je proces, pri ktorom sa triglyceridy (TGL) uložené v tukovom tkanive hydrolyzujú za vzniku glycerolu a mastných kyselín (FA) pomocou enzýmu tuková triglycerid lipáza (ATGL) 8. Charakteristickou črtou obezity sú zmeny v bazálnej a stimulovanej lipolýze. Asálna lipolýza je regulovaná ATGL aktiváciou 9, ktorá prevádza TGL na diacylglycerol (DAG), ktorý sa potom hydrolyzuje na monoacylglycerol (MAG). Aktivácia hormonálne senzitívnej lipázy (HSL) prostredníctvom adenylylcyklázy aktivuje stimuláciu proteínkinázy A (PKA) závislú od cyklického adenozínmonofosfátu (cAMP) a spôsobuje lipolýzu. Meranie bazálnej a stimulovanej lipolýzy je preto dôležité na analýzu aktivity proteínov zapojených do tohto procesu. Dešifrovanie molekulárnej regulácie lipolýzy môže byť tiež užitočné pri vývoji nových terapeutických stratégií proti obezite 10. Pretože molekuly, ktoré stimulujú lipolýzu a oxidáciu mastných kyselín, sú potenciálnymi kandidátmi na redukciu tukov uložených v skladoch, je dôležité použiť dôkladný test reprodukovateľnosti.

Doteraz publikované údaje naznačujú, že aktivácia proteínu TRPV1, exprimovaného v bielom tukovom tkanive, pomocou CAP a FSK (aktivátor adenylylcyklázy) stimulovala lipolýzu v inguinálnych tukových vankúšikoch 11. Doterajší výskum tiež naznačuje, že dlhodobá aktivácia TRPV1 pomocou CAP aktivuje PKA12. Pretože aktivácia PKA stimuluje lipolýzu 13, 14, bazálna aj PKA závislá stimulovaná lipolýza v inguinálnych tukových vankúšikoch, ktoré po 32 týždňoch kŕmenia príslušnými diétami NCD alebo HFD (± CAP) -Fed- Myši sa izolovali, aby sa potvrdila úloha aktivácie TRPV1 pri lipolýze

Tento článok popisuje efektívnu metódu na stanovenie bazálnej a stimulovanej lipolýzy. Aj keď sú k dispozícii ďalšie metódy, ktoré poskytujú rádioaktívne izotopy glycerínu a zdĺhavú vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu alebo plynovú chromatografiu/hmotnostnú spektrometriu na merania 15, 16, táto metóda poskytuje priamu, jednoduchú a lacnú techniku ​​na stanovenie lipolýzy v tukovom tkanive.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Všetky protokoly sa riadia pokynmi University of Wyoming v oblasti dobrých životných podmienok zvierat.

1. Chov a kŕmenie zvierat

POZNÁMKA: Dospelé myši divokého typu (C57BL/6) (vo veku 12 až 24 týždňov) boli chované vo výskumnom zariadení podľa protokolov schválených Výborom pre ústavnú starostlivosť a použitie zvierat (IACUC).

  1. Od 6. týždňa veku chovajte myši v skupinách po štyroch v samostatných klietkach a náhodne ich zaraďujte do kŕmnych skupín NCD alebo HFD (± 0,01% CAP) až do 38. týždňa veku.
    POZNÁMKA: CAP je agonista proteínu kanála TRPV1 exprimovaného v tukových tkanivách 11, 17. Zmiešajte CAP s HFD v mixéri v kukle a zmiešanú zmes preložte na podnos s malými 1 na 2 rozdeľovačmi. Uchovávajte tácku v mrazničke -20 ° C. Po 24 hodinách vyberte tácku s diétou HFD + CAP z mrazničky a až do použitia ju uložte do nádoby pri -20 ° C.
  2. Domáce myši v klimatizovanom prostredí (22,8 ± 2,0 ° C, vlhkosť 45 - 50%) s cyklom 12/12 svetlo/tma s prístupom k určenej strave a vode ad libitum .
  3. Na konci 38 týždňov vylúčte tukové tukové tkanivo a použijete ho na lipolýzové experimenty (časti 2-7).

2. Pripravte myši na experimenty

  1. Anestetizujte myši injekciou zmesi ketamínu a xylazínu (10 mg/kg alebo 80 mg/kg telesnej hmotnosti). Injekcia 0,01 ml zmesi/10 g telesnej hmotnosti myši.
  2. Potvrďte hlbokú anestéziu pevným zovretím špičky. Ak je prítomný pedálový reflex, znovu otestujte myš najmenej po 30 sekundách.
  3. Na zabránenie suchosti očí počas anestézie používajte veterinárne lieky. Počas žiadneho z postupov nenechávajte myši bez dozoru.
  4. Euthanizácia myší injekciou vysokej dávky zmiešanej injekcie s ketamínom a xylazínom (10 mg/kg a 80 mg/kg telesnej hmotnosti) E (0,01 ml/10 g telesnej hmotnosti) s následnou dislokáciou krčka maternice.
    POZNÁMKA: Túto metódu eutanázie schvaľuje IACUC University of Wyoming.

3. Izolácia vankúšikov tukového tuku

15 min).

  • Izolujte tukové vankúšiky z pravej strany myši, ako je popísané v krokoch 3.2-3.6.

    • 4. Uvoľňovanie bazálneho glycerolu z inguinálnych tukových vankúšikov

    5. FSK stimulovaná lipolýza

    6. Príprava voľného glycerolového činidla

    1. Rekonštituujte glycerolové činidlo 19 v 40 ml deionizovanej vody v injekčnej liekovke z jantárového skla, na injekčnú liekovku vložte zátku a premiešajte 10-krát. Nemiešajte pretrepaním.
    2. Injekčnú liekovku uchovávajte pri 4 ° C v chladničke mimo dosahu svetla tak, že ju úplne zakryjete hliníkovou fóliou.
    3. Pokračujte v príprave glycerínového štandardu (časť 7).

    7. Príprava glycerínového štandardu a stanovenie obsahu glycerínu

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Reprezentatívne výsledky

    Lipolýza
    (Nmol glycerínu/mg proteínu/h)         		NCD
    (N = 6)         		HFD
    (N = 6)         		HFD + CAP
    (N = 6)
    Bazálny 16,22 ± 1,28 17,16 ± 1,48 52,07 ± 2,66
    FSK stimuluje
    (S triacínom C)    		 54,88 ± 3,27 41,23 ± 4,43 72,04 ± 4,16

    Tabuľka 1: Účinok CAP na bazálnu a FSK stimulovanú lipolýzu v inguinálnych tukových vankúšikoch. Priemerné bazálne a FSK stimulované uvoľňovanie glycerolu ± SEM, merané v inguinálnom tukovom tkanive, získané od myší divokého typu kŕmených NCD, HFD alebo HFD + CAP.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Diskusia

    Proces degradácie TGL na glycerol a mastné kyseliny je katalyzovaný ATGL 9 počas bazálnej lipolýzy a riadený množstvom proteínov vrátane aktivácie dráhy závislej od adenylyl cyklázy/PKA počas stimulovanej lipolýzy 21, 22, 23. Zvyšovanie lipolýzy zvyšuje plazmatické hladiny mastných kyselín na prepravu a výdaj energie 24. Mastné kyseliny absorbujú mitochondrie ako acetyl-CoA, ktorý sa používa na energiu.

    Tento článok popisuje metódu merania uvoľňovania glycerínu z bieleho tukového tkaniva. Aj keď je k dispozícii niekoľko metód so stabilnými izotopmi glycerínu, pre merania 15, 16 vyžadujú buď vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu, alebo plynovú chromatografiu/hmotnostnú spektrometriu. Merania glycerínového rádioaktívneho značenia sú tiež spojené s nešpecifikami 31. Alternatívne metódy zahŕňajú stanovenie hladín mRNA a proteínov lipáz a regulačných proteínov zapojených do lipolýzy. Pre údaje o koncentrácii mastných kyselín s dlhým reťazcom v obehu sú k dispozícii aj kolorimetrické metódy. Tu opísaná metóda je veľmi efektívna pri analýze uvoľňovania glycerolu z tukových tkanív, ako je to možné pomocou čítačky doštičiek schopnej merať fluorescenciu a absorbanciu. Zjednodušená analytická metóda na uvoľňovanie glycerolu opísaná v tomto článku tiež poskytuje lepšiu stabilitu a presnosť 32 .

    Mali by sa vykonávať štandardné operačné postupy, pretože táto metóda zahŕňa chirurgické techniky na izoláciu tukových usadenín. Tento protokol odporúča použitie BSA bez tukov. To môže viesť k tvorbe vzduchových bublín, ktoré ovplyvnia meranie absorpcie. Je preto dôležité zabezpečiť, aby sa so vzorkami manipulovalo tak, aby sa zabránilo vzniku vzduchových bublín. Je potrebné dbať na to, aby sa vzorky počas liečby BSA netriasali alebo neobracali, pokiaľ sa v protokole takýto krok neodporúča. Krok extrakcie tuku z inguinálneho tuku je tiež kritický, pretože prítomnosť tuku interferuje s určením proteínu H inguinálneho tukového tkaniva. Pri príprave glycerínových štandardov je navyše dôležité obsah premiešať inverzne a injekčnou liekovkou netraste.

    Tu opísaný postup je možné použiť na úspešnú izoláciu inguinálnych tukových vankúšikov pre viaceré testy, vrátane meraní lipolýzy. Protokol lipolýzy opísaný pre inguinálne tukové vankúšiky sa dá ľahko rozšíriť na meranie lipolýzy v iných tkanivách. Metódy sú optimalizované pre všetky typy tukových vankúšikov a preadipocytov.

    V súhrne tento článok popisuje metódu na meranie bazálneho a FSK stimulovaného uvoľňovania glycerolu v inguinálnych mastných kyselinách izolovaných z NCD alebo HFD (± CAP) myší Fed. Prezentované údaje naznačujú, že aktivácia TRPV1 pomocou CAP zvýšila bazálnu a FSK stimulovanú lipolýzu a zabránila akumulácii lipidov v tukovom tkanive. Tieto údaje ukazujú rozhodujúcu úlohu pre proteín TRPV1 pri regulácii lipolýzy v bielom tukovom tkanive

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.