Nová fotoakustická mikroskopia a optická koherenčná tomografia Dual-modálne chorioretinálne zobrazovanie

Zhrnutie

Tento rukopis popisuje novú štruktúru a činnosť dvojakého systému fotoakustickej mikroskopie a optickej koherenčnej tomografie pre neinvazívne chorioretinálne zobrazovanie väčších zvierat, ako sú králiky, bez označenia.

Abstrakt

Úvod

V posledných desaťročiach došlo k prudkému vývoju v oblasti biomedicínskeho fotoakustického zobrazovania 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7., 8. Na základe energetickej premeny svetla na zvuk vznikajúce fotoakustické zobrazovanie vizualizuje biologické vzorky v mierkach organel, buniek, tkanív, orgánov, celých tiel malých zvierat a dokáže odhaliť ich anatomické, funkčné, molekulárne, genetické a metabolické informácie 1, 2, 9, 10, 11, 12. Fotoakustické zobrazovanie našlo jedinečné použitie v mnohých biomedicínskych poliach, bunkovej biológii 13, 14, vaskulárnej biológii 15, 16, neurológii 17, 18., Oncology 19, 20, 21, 22, Dermatology 23, Pharmacology 24 and Hematology 25, 26. Jeho aplikácia v oftalmológii, d. H. fotoakustické očné zobrazovanie vyvolalo značný záujem vedcov a lekárov a v súčasnosti sa aktívne študuje.

Za týmto účelom sme nedávno hlásili neinvazívne chorioretinálne zobrazovanie bez označenia u živých králikov pomocou integrovanej fotoakustickej mikroskopie (PAM) a spektra OCT (SD-OCT) 38. Systém má vynikajúci výkon a bol schopný vizualizovať sietnicu a cievnatku očí väčších zvierat na základe endogénnej absorpcie a rozptylového kontrastu očného tkaniva. Predbežné výsledky u králikov ukazujú, že PAM dokáže pomocou dávky laserového žiarenia neinvazívne odlíšiť jednotlivé krvné cievy sietnice a cievovky (

80 nJ) hlboko pod bezpečnosťou American National Standards Institute (ANSI) (160 nJ) pri 570 nm- 39; a nástroj Office Fitting Tool mohol jasne vyriešiť rôzne vrstvy sietnice, choroidu a skléry. Je to prvá ukážka zobrazenia zadných segmentov väčších zvierat pomocou PAM a pravdepodobne dôležitý krok ku klinickému prekladu vzhľadom na to, že veľkosť očnej gule králikov (18,1 mm) 40 predstavuje takmer 80% osovej dĺžky technológie u ľudí (23, 9 mm).

V tejto dizertačnej práci poskytujeme podrobný popis zobrazovacieho systému s dvojitou modalitou a experimentálne protokoly používané na neinvazívne zobrazovanie chorioretinálneho zobrazenia bez označenia u živých králikov a demonštrujeme výkonnosť systému prostredníctvom reprezentatívnych výsledkov zobrazenia sietnice a choroidu.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Králiky sú kryté druhmi amerického ministerstva poľnohospodárstva (USDA). Jeho použitie v biomedicínskom výskume musí byť prísne regulované. Všetky pokusy na králikoch sa uskutočňovali podľa Deklarácie ARVO (Asociácia pre výskum zraku a oftalmológie) pre použitie zvierat pri oftalmologickom a zrakovom výskume po schválení laboratórneho protokolu pre zvieratá univerzitou. Výbor Michiganskej univerzity pre používanie a starostlivosť o zvieratá (UCUCA) (protokol PRO00006486, PI Yannis Paulus).

  1. Po preskúmaní fundusu pomocou fundusovej kamery oddeľte V-gél, ak je pripojený. Vypláchnite oko výplachom očí, aplikujte očný flurbiprofén a neomycín a polymyxín B sulfáty a oftalmickú masť dexametazón a zavrite oči.
  2. Králika preneste s prikrývkou vody, ktorá cirkuluje, do regeneračnej komory. Chráňte obsah škatule pred svetlom a počkajte, kým sa králik neprebudí prirodzene. Počas tejto doby monitorujte vnútornosti zvierat každých 15 minút a uchovajte záznam a zariadenie pre zvieratá kópiu na ďalšiu archiváciu.
  3. Hneď ako sa králik prebudí a bude aktívny, v strehu a bude kráčať normálne, dopravte ich späť do zvieracieho zariadenia. Ak sa plánuje akútny experiment, eutanázujte zviera roztokom eutanázie (napr. Beuthanasia, 0,22 ml/kg, intravenózna injekcia do žily na okraji ucha) a jatočné telo zlikvidujte.
  4. Zapnite softvér a lasery. Vyčistite optickú lavicu.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Zobrazovací systém s dvojitou modalitou a experimentálny protokol boli úspešne testované v laboratóriu autorov so štyrmi novozélandskými bielymi králikmi. Nasleduje ukážka niektorých reprezentatívnych výsledkov.

ilustrácia 1 ukazuje schému zobrazovacieho systému s dvojmodalitou PAM a SD-OCT. Skladá sa z nasledujúcich modulov: fotoakustický svetelný zdroj, variabilný laserový útlm, lúčový kolimátor, merač energie, skenovacia hlava, fotoakustický detekčný a akvizičný modul, zariadenie OCT a synchronizačná elektronika. Podrobné konfigurácie systému sú uvedené v oddiele 1.1.

Obrázok 2 ukazuje typické výsledky zobrazovania ciev cievnatky králika získané pomocou zobrazovacieho systému s dvojitou modalitou. Obrázok 2 a) je fotografia fundusu ukazujúca, že choroidálne cievy sú distribuované na väčšine zajačieho fundusu, zatiaľ čo sietnicové cievy sú obmedzené v dreňovom lúči. Obrázok 2 b) je typický obraz PAM zobrazujúci vaskulatúru choroidu na fotografii fundusu. Cievne cievy boli ohraničené na vysoké bočné rozlíšenie. Obrázok 2 c) je obraz OCT B-skenovania získaný, ktorý vám umožní pozrieť sa na anatómiu fundusu a potvrdí prítomnosť choroidálnych ciev. Sieťku, choroid a skléru bolo možné vizualizovať s vysokým axiálnym rozlíšením s cievami cievnatky pod maliarskou vrstvou pigmentového epitelu sietnice (RPE).

Obrázok 3 ukazuje typické výsledky zobrazovania králičej vaskulatúry sietnice získané pomocou zobrazovacieho systému s dvojitou modalitou. Obrázky 3 písmeno a a Číslo 3 písmeno b 2D MIP a 3D objemové znázornenie sietnicových ciev získa PAM. Obrázok 3 c) zobrazuje ortogonálne rezy 3D obraz. Výsledky ukazujú, že PAM môže tiež vizualizovať jednotlivé sietnicové cievy, ktoré ležia nad úrovňou RPE, a potvrdiť, že sietnicové cievy a choroidálne cievy sú v rôznych hĺbkach. Obrázok 3 d) ukazuje zodpovedajúci obraz OCT B, ukazuje prierezy jednotlivých sietnicových ciev a vrstvu nervových vlákien (NFL).

koherenčná

ilustrácia 1. Schéma integrovaného dvojmodálneho zobrazovacieho systému fotoakustickej mikroskopie a optickej koherenčnej tomografie. OPO: Optický parametrický oscilátor; BS: rozdeľovač lúčov; PD: fotodióda; M: zrkadlo; DM: dichroické zrkadlá; SL: skenovací objektív; OL: očná šošovka; SMF: jednovidové vlákno; DCG: sklo na kompenzáciu disperzie; CCD: nabíjačka - spojená. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

nová

Obrázok 2. PAM a OCT duálne modálne zobrazovanie ciev cievnatky u králika. a) Fotografie fundusu ukazujú, že celé cievne cievy fundusu (CV) sú rozptýlené, zatiaľ čo sietnicové cievy (RV) sú uzavreté v dreňovom lúči, pretože králiky sú merangiotické zvieratá. (b) PAM C obraz CV zobrazujúci, že PAM môže vymedziť CV na vysoké bočné rozlíšenie. c) Obrázok OCT B zobrazuje anatomickú štruktúru fundusu králika a osovú polohu ciev cievnatky. GCL: vrstva gangliových buniek; INL: jadrová vnútorná vrstva; IPL: vnútorná plexiformná vrstva; ONL: jadrová vonkajšia vrstva; OPL: vonkajšia plexiformná vrstva; OLM: vonkajšia obmedzujúca membrána; EZ: Elipsoidná zóna; MZ: myoidná zóna; OS: vonkajší segment; BM, Bruchova membrána; IZ: interdigitačná zóna 38. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

optická

Obrázok 3. PAM a OCT duálne modálne zobrazovanie sietnicových ciev u králikov. (a) PAM C obraz RV a CV. (b) 3D objemové vykreslenie obrazu PAM. (c) 2D ortogonálne rezy obrazu PAM ukazujú RV a CV v rôznych hĺbkach. (d) Obrázok OCT B zobrazujúci RV, NFL a skléru 38. Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Pre kvalitný obraz fundusu je nevyhnutný neporušený a pravidelný slzný film. Nepravidelné a zhoršené trhacie filmy môžu významne ovplyvniť kvalitu obrazu 42. Aby ste sa vyhli celistvosti slzného filmu a povrchovej bodovej keratopatii rohovky, je dôležité rohovku veľmi často, približne každé dve minúty, mazať výplachom očí. Ak existujú obavy z nepriehľadnosti oka, použite štrbinovú lampu a fluoresceínové prúžky na kontrolu stavu rohovky.

Pre zobrazenie zadného segmentu očí väčších zvierat môže existovať niekoľko ťažkostí, vrátane útlmu fotoakustického signálu so vzdialenosťou, najmä pre vysokofrekvenčné zložky, dehydratácie rohovky a optických aberácií. Amplitúda fotoakustického signálu zvyčajne zažíva značné zoslabenie predtým, ako je detekovaná ultrazvukovým prevodníkom v tvare ihly. Čím väčšia je očná guľa, tým väčší je útlm. Veľkosť očnej bulvy králika (

18,1 mm) je asi trikrát väčší ako u potkanov a šesťkrát väčší ako u myší, čo zvlášť komplikuje zobrazovanie zajačieho oka. Pre primeranú kvalitu obrazu sa uprednostňuje laserový lúč s malým priemerom (2 mm za lúčom kolimátora v tejto štúdii) a kolimovaný vlnoplocha (ideálne rovinné vlnoplocha), pretože bude minimálne ovplyvnený vnútornými optickými aberáciami rohovky a môže dobre ovplyvňovať sietnicu. byť zameraný. Tento bod je rozhodujúci z hľadiska zníženia expozičnej dávky laseru a zlepšenia rozlíšenia obrazu. Okrem toho ultrazvukový menič so strednou frekvenciou 27 MHz namiesto vyššou strednou frekvenciou na základe experimentálnych výsledkov naznačuje, že ide o maximálny ultrazvukový signál v tejto vzdialenosti.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Zverejnenie

Autori nič neprezradili.

Poďakovanie

Táto práca bola podporená štedrou podporou Národného očného inštitútu 4K12EY022299 (YMP), Fight for Sight-International Retinal Research Foundation FFS GIA16002 (YMP), plnou podporou výskumu v oblasti prevencie slepoty a katedrou oftalmológie University of Michigan. a vizuálne vedy. Táto práca využila Core Center pre víziu výskumu P30 EY007003 financovaného Národným očným inštitútom.