Povrchová pasivácia pre protokol o molekulárnych proteínoch s jednou molekulou (preložené do nemčiny)

Zhrnutie

Popisujeme metódu pasivácie skleneného povrchu pomocou polyetylénglykolu (PEG). Tento protokol zahŕňa čistenie povrchu, funkcionalizáciu povrchu a PEG poťahovanie. Zavádzame novú stratégiu liečby povrchu molekulami PEG v dvoch kolách, ktorá vedie k vynikajúcej kvalite pasivácie v porovnaní s existujúcimi metódami.

Abstrakt

Úvod

Pri uskutočňovaní štúdie s jednou molekulou proteínu je dôležité dosiahnuť vysokú kvalitu pasivácie, aby bol experiment zbavený akejkoľvek povrchovo indukovanej poruchy alebo denaturácie proteínu 1,2. Zatiaľ čo sa pri štúdiách nukleových kyselín s jednou molekulou 3 bežne používa sklenený povrch s povrchovo aktívnymi látkami, ako je hovädzí sérový albumín, úroveň pasivácie nie je pre štúdie proteínov dostatočne vysoká. Sklenený povrch potiahnutý polymérom (polyetylénglykol, PEG) je vynikajúci v pasivácii 4-6. Pritom sa široko používa pre štúdie s jednou molekulou proteínu, pretože bola zavedená pre štúdiu s jednou molekulou fluorescencie 7/10. Proces poťahovania polymérom niekoľko povrchových úprav 7,11,12. Preto je ťažké dodržať celý postup bez podrobných pokynov. Úroveň povrchovej pasivácie sa často líši v závislosti od použitého protokolu. Tu uvádzame robustný protokol s podrobnými pokynmi, ktorý odstráni jedno z hlavných úzkych miest štúdií s jednou molekulou proteínu. Prosím odkáž ilustrácia 1 pre prehľad.

Protokol

1. Príprava a čistenie diapozitívu

Mikrofluidná komora pozostáva z kremenného sklíčka a krycieho sklíčka. Pri mikroskopii s hranolovým totálnym vnútorným odrazom (TIRF) sa povrch podložného sklíčka zobrazí. Preto je dôležité kremenné sklíčko dôkladne vyčistiť roztokom H20, acetónu, KOH a pirane. Th viacstupňové čistenie odstráni fluorescenčné organické molekuly na povrchu, ktorý interferuje s meraniami fluorescencie s jednou molekulou. Vďaka leptaniu na pirane je kremenný povrch hydrofilný vytváraním hydroxylových skupín. Voľné hydroxylové skupiny sú pre amino-silanizačnú reakciu v kroku 3.

Mikrofluidná komora sa skladá z kremenného sklíčka a pery krytu. Pri použití mikroskopu TIRF s hranolom sa povrch krycieho skla nezobrazí. Preto postačuje krycí list vyčistiť iba pomocou H20 a KOH. V prípade, že je potrebné zobraziť krycie sklíčko (napr. Pomocou mikroskopie TIRF cieľového typu), odporúča sa ošetriť krycie sklíčka roztokom pirane (krok 1.7). Upozorňujeme, že ak PEGylácia horného povrchu nie je vysoko kvalitná, môže pôsobiť ako zachytávač proteínov a viesť k výkyvom v koncentrácii proteínov.

  1. Opláchnite vodou. Vložte krycie sklíčka (24 x 30, 24 x 40 alebo 24 x 50 mm 2) do sklenenej kyvety. Typicky je 5 až 15 krycích listov umiestnených do jednej nádoby. Opláchnite krycie sklíčka trikrát MilliQ H 2 O
  2. Čistenie pomocou KOH. Vodu vymeňte za 1 M KOH a krycie sklíčka sonikujte po dobu 20 minút alebo dlhšie.
  3. Opláchnite H20. Krycie sklíčka 3x opláchnite MilliQ H20, aby ste odstránili stopy KOH. Pokračujte krokom 3.

3. Aminosilanizácia fólií a krycích skiel

Funkcionalizácia povrchu kremenných podložných sklíčok a krycích sklíčok s amínovou skupinou prostredníctvom amino-silanizačnej chémie. Ako rozpúšťadlo sa použije metanol a ako katalyzátor pre amino-silanizačnú reakciu kyselina octová.

  1. Opláchnite metanolom. Nahraďte MilliQ H20 vo farbiacich miskách (z KROKOV 1 a 2) metanolom. Podložky a krycie sklíčka uchovávajte v metanole až do bodu 3.3. Pretože nečistoty v metanole, fólie a kryt kĺžu v metanole zbytočne dlho (napr. Niekoľko hodín), adsorbujú sa na povrch.
  2. Pripravte si amino-silanizačný roztok.
    1. Pyrexovú banku niekoľkokrát prepláchnite metanolom. Banky sa sonikujú s metanolom 5 minút alebo dlhšie. Odporúča sa mať vyhradený piest, ktorý je udržiavaný čistý.
    2. Do banky sa pridá 100 ml metanolu.
    3. 5 ml kyseliny octovej.
    4. 3 ml APTES (3-aminopropyltrimetoxysilán) a jemne pretrepať.
  3. Aminosilanizácia. Nahraďte metanol v miskách, ktoré obsahujú farbiace sklíčka a krycie sklíčka, aminosilanizačnou reakčnou zmesou.
    1. Inkubácia 20 - 30 minút. Počas inkubácie sa sonikuje jedenkrát 1 minútu.
  4. Opláchnite metanolom. Eininozilačná reakcia sa nahradí metanolom. Metanol zlikvidujte a pridajte nový roztok metanolu. Tento postup opakujte trikrát.

4. Pasivácia povrchu pomocou polyméru (prvé kolo)

Povrch kremenných sklíčok a krycích sklíčok pasivujte amínom pokrytím konjugáciou NHS esteru a polyetylénglykolu (PEG). Táto reakcia sa uskutočňuje cez noc s nasýtenou koncentráciou roztoku PEG pri pH 8,5.

Skladujte PEGylované podložné sklíčka a krycie sklíčka v N 2 pri -20 ° C.

  1. Sklíčka na sušenie a krycie sklíčka. Posunutím krycieho sklíčka na jednu stranu opatrne demontujte sklíčko a krycie sklíčko, opláchnite ich MilliQ H 2 O a osušte N 2.
  2. Uložte diapozitívy a krycie sklíčka. Na okamžité použitie postupujte podľa postupu pre druhé kolo PEGylácie (krok 6). Ak chcete šetriť dlhšie, postupujte podľa ďalších krokov.
    1. Vložte pár podložných sklíčok a krycieho sklíčka do 50 ml skúmavky tak, aby PEGylované povrchy smerovali od seba.
    2. Skúmavku čiastočne zatvorte, vákuovo ju naplňte a naplňte ju N 2. Tieto kroky pomáhajú zachovať PEGylovanú oblasť po dlhšiu dobu. Hadicu pevne priskrutkujte a skladujte pri -20 ° C. Kvalita fólií zostáva dobrá až 3 mesiace (Obrázok 3 vpravo).

6. Pasivácia povrchu pomocou polyméru (druhé kolo)

Ďalšie kolo PEGylácie, aby sa vrstva PEG stala hustejšou a tiež na potlačenie zvyšných aminoskupín na povrchu. Použitie krátkych PHS molekúl NHS esteru (333 Da) bude účinné pri penetrácii do existujúcej PEG vrstvy. Toto druhé kolo PEGylácie sa odporúča vykonať tesne pred prezentáciou.

  1. Pripravte reakčný pufor. Pripravte čerstvý 0,1 M roztok hydrogenuhličitanu sodného (pH 8,5). Môže sa tiež použiť zmrazený roztok z kroku 4.2.
  2. Pripravte si PEGylačný roztok. 7 μl 250 mM MS4-PEG sa rozpustí v 63 μl pufru hydrogenuhličitanu sodného.
  3. PEGylácia. Postupujte rovnako ako v kroku 4.4. Inkubácia po dobu 30 minút až cez noc.
  4. Sklíčka na sušenie a krycie sklíčka. Dvojicu sklíčok a krycieho sklíčka rozložte, opláchnite MilliQ H 2 O, osušte N 2 a uložte do čistej pipetovacej škatule. Ak chcete zostaviť mikrofluidnú komoru, prejdite na krok 7.

7. Zostavte mikrofluidnú komoru

Zostavte mikrofluidnú komoru s párom kremenného sklíčka PEG a krycieho sklíčka. Ako rozpera sa používa obojstranná páska. Komora je utesnená epoxidom, takže roztoky sa zavádzajú cez otvory v kremennom sklíčku.

Recyklované kremenné podložné sklíčka. Použité fólie sa recyklujú odstránením krycích líšt a obojstrannej lepiacej pásky.

  1. Po použití sa komory skladujú vo vode z vodovodu. Dlhodobá inkubácia vo vode uľahčuje demontáž komôr.
  2. Varte komory vo vode z vodovodu pomocou mikrovlnnej rúry. Použite kadičku Pyrex. Varíme 10 minút alebo viac.
  3. Vezmite krycie sklíčka a obojstrannú pásku so žiletkou. Zatlačíte na quartzový sklíčko nie kolmo na jeho rovinu. Inak sa to zlomí. Žiletku udržujte mimo kanála. Nebojte sa, inak to poškriabe kanál.
  4. Opláchnite diapozitívy domácim čistiacim prostriedkom tak, že ich pretriete prstami.
  5. Zasuňte do sklenenej kyvety. Typicky je možné podať 5 až 15 podložných sklíčok do jednej nádoby. V 10% čistiacom prostriedku pre domácnosť a sonikujte podložné sklíčka 20 minút alebo dlhšie. Opláchnite veľkým množstvom podložných sklíčok s vodou.
  6. Prejdite na krok 1.2.

Reprezentatívne výsledky

Po usporiadaní mikrofluidnej komory (kroky 7.1 až 7.6) a pred vykonaním kroku 7.7 sa odporúča vykonať kontrolu kvality povrchu PEG.

Pokiaľ bola povrchová pasivácia vykonaná úspešne, bolo pozorovaných menej ako 10 nešpecificky adsorbovaných proteínov na zobrazovaciu oblasť (25 mm x 25 mm), keď bol 1 až 10 nM fluorescenčne označený proteín (Obrázok 3, vľavo) vložte do komory.

Ak jeden z krokov čistenia alebo reakcie nie je vykonaný správne, zvyšuje sa počet nešpecificky adsorbovaných proteínov a obrazovka CCD sa môže nasýtiť fluorescenčnými signálmi. Napríklad, ak je piranha lept preskočený, je pozorované 100-násobné množstvo nešpecifickej adsorpcie (Obr. 3a, s v strede vľavo porovnať). Ak je druhý krok PEGylácie vynechaný, bolo pozorované približne 3-krát väčšie množstvo nešpecifickej adsorpcie (Obrázok 3b). Bol pozorovaný nízky stupeň PEGylácie, keď expirované chemikálie (napr. APTES boli skladované pri teplote miestnosti niekoľko mesiacov) (údaje nie sú uvedené). Kvalita povrchu tiež klesá, ak od doby, keď existuje PEGylovaný typ, uplynulo značné množstvo času (Obrázok 3a, viď. Vľavo S správny).

Pokiaľ je nám známe, je to prvýkrát, čo boli pre štúdie s jednou molekulou zavedené dve kolá PEGylácie. Dve kolá PEGylácie zaručujú najvyššiu kvalitu tvorby vrstvy PEG (Obrázok 3b). Vynikajúci typ dvojitej PEGylácie je zreteľne uvedený vo filmoch (porov. 1a film S Film - 1b). V týchto filmoch sú signály pozadia z fluorescenčných molekúl pozorované v roztoku použité oveľa slabšie ako dvojitá PEGylácia, čo znamená, že proteíny sú tak odpudzované dvojitou PEGylovanou vrstvou. Aj keď je dvojstupňový postup veľmi odporúčaný, môže byť druhý krok PEGylácie preskočený, ak je váš experiment tolerovateľný pre neoptimálnu pasiváciu.

povrchová
Obrázok 1:. Schéma povrchových úprav (a) sklíčko sa vyčistilo acetónom, KOH a roztokom pirane. Je PEG funkcionalizovaný APTES a PEG-NHS esterom. (B) Krycia sklíčko sa očistí KOH a, ak je to potrebné, roztokom pirane. Je PEG funkcionalizovaný APTES a PEG-NHS esterom.

fig2highres.jpg "width =" 500 "/>Obrázok 2:. Mikrofluidná komora (a) Jednokanálová komora. Na podložnom sklíčku mikroskopu sú vyvŕtané dva otvory. Montuje sa krycím sklzom s dvoma tabuľami obojstrannej pásky. (B) Trojkanálová komora. Na podložnom sklíčku mikroskopu je vyvŕtaných šesť otvorov. Je pripevnený krycím sklíčkom so štyrmi tabuľami obojstrannej pásky.

protokol
Obrázok 3: CCD obrazy s farbivo značenými proteínmi zaznamenané v roztoku. (A) CCD obrazy boli zaznamenané v roztoku hranolovou fluorescenčnou mikroskopiou s vnútorným odrazom so 60-násobným objektívom s 10 nM Cy3-značenou Rep. (Vľavo) Plocha A bola vytvorená podľa protokolu v tomto článku. (Stred) Jeden povrch bol upravený podľa protokolu v tomto článku, ale preskočil piranhu. (Vpravo) A-povrch bol pripravený podľa protokolu uvedeného v tomto článku a skladovaný po dobu 3 mesiacov pri -20 ° C pod dusíkom. (B) CCD obrazy zaznamenané s 10 nM Cy3-etiketou Rep v roztoku. (Vľavo) Plocha A bola vytvorená podľa protokolu v tomto článku. (Vpravo) A-povrch bol pripravený podľa protokolu v tomto článku, ale druhé kolo PEGylácie bolo vynechané. Stupnica = 5 um.

Film 1: CCD filmy s farbivo značenými proteínmi zaznamenanými v roztoku. CCD filmy boli zachytené v roztoku hranolovou fluorescenčnou mikroskopiou s vnútorným odrazom so 60-násobným objektívom s 10 nM Cy3-značenou Rep. Časové rozlíšenie je 100 ms. (A) Povrch bol vyrobený pomocou protokolu uvedeného v tomto článku. (B) A-povrch sa pripravil podľa protokolu v tomto článku, ale druhé kolo PEGylácie sa vynechalo. Kliknutím sem zobrazíte film-1a a kliknutím sem zobrazíte film-1b.

Diskusia

Kritické kroky v rámci tohto protokolu

Pred amino-silanizačnou reakciou je dôležité urobiť povrch hydrofilným. To sa dosiahlo leptaním pirane, pri ktorom sa na povrchu skla/kremeňa vytvorili voľné hydroxylové skupiny. Odporúča sa ponechať leptaný povrch pirane na H20 alebo na vzduchu po dlhšiu dobu, pretože je vystavená hydrofilnosť povrchu a klesá.

Molekuly PHS esteru NHS sú reaktívne. Odporúča sa pripraviť čiastočné množstvo a uskladniť ich pod dusíkom pri -20 ° C. Čas použiteľnosti chemikálie APTES pri izbovej teplote je nízky. Odporúča sa každý mesiac vymeniť za nový.

Úpravy tohto protokolu

Ak nepoužívate leptanie na pirane z nejakého praktického dôvodu, môžete leptať KOH dlhšiu dobu (napr. Cez noc), čo ho tiež vystaví pôsobeniu hydroxylových skupín. Úskalím tohto alternatívneho prístupu je, že posúvač sa po niekoľkých opakovaniach stane nepoužiteľným kvôli silným škrabancom.

Často sa praktizuje spaľovanie propánového horáka na sklo/kremeň, ktorý je účinný pri odstraňovaní fluorescenčných organických materiálov 7. Tento postup bol zahrnutý do tohto protokolu, pretože ide o nadbytočné leptanie piraňou. Upozorňujeme, že tento postup môže viesť k oxidácii hydroxylových skupín. Preto by sa tento postup nemal robiť, ak bol povrch leptaný pomocou roztoku KOH alebo pirane.

Ak sa na zobrazovanie jednej molekuly použije pufor s pH nižším ako 7, konformácia sa zmení z „huby“ na PEG na „kefku“, čo naznačuje stupeň pasivácie. Preto ak sa použije pH nižšie ako 7,0, odporúča sa povrch s disukcínimidylesterom tartarátom 7.

Perspektívy

Táto práca priniesla robustný protokol na dosiahnutie vysoko kvalitnej povrchovej pasivácie. Tento protokol bude užitočný pre fluorescenčné štúdie s jednou molekulou, ktoré zahŕňajú proteíny 14 a 15 imunoprecipitované s proteínmi, ako aj proteínové komplexy v bunkových extraktoch. Je široko používaný pre iné techniky s jednou molekulou, ako je spektroskopia sily a krútiaceho momentu 16. Tiež sa použije na zabránenie adsorpcii buniek na povrch 17.

Protokol uvedený v tejto práci vyžaduje viacstupňový postup. Ako alternatívy sú k dispozícii povrchové pasivácie lipidom-PEG-8 a poly-lyzínom-PEG-9. Pretože nevyžadujú žiadne chemické reakcie, je ľahké ich implementovať. Stupeň pasivácie však nie je taký vysoký ako stupeň dosiahnutý chemickou úpravou povrchu.

Zverejnenie

Nemáme čo prezradiť.

Poďakovanie

SDC, ACH a CJ boli podporené zo strany Starting Grants (ERC StG ​​- 2012-309509) od Európskej rady pre výskum. Program J.-MN podporila Kórejská národná výskumná nadácia (NRF) (2011-0018198); a program výskumného centra Pioneer (2012-009586) financovaný NRF v Kórei prostredníctvom Ministerstva vedy, IKT a plánovania budúcnosti (MSIP). Túto prácu podporilo aj Centrum pre zdravie BioNano-Guard spoločnosti MSIP Korea ako projekt globálnej hranice (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). Spoločnosti YKL a J.-HH boli podporené zo štipendijného vedeckého programu v Soule mesta Soul v Kórei. Označený proteín Rep bol štedrým darom Dr. Sua Myong.