Štúdie distribúcie imunitných buniek v periférnej krvi u obéznych vyvolaných stravou

1 Z Ústavu pre anatómiu a bunkovú biológiu Lekárskej fakulty Univerzity Martina Luthera v Halle-Wittenberg Riaditeľ: Prof. Dr. med. Heike Kielstein Vyšetrovanie distribúcie imunitných buniek v periférnej krvi na modeli obéznych potkanov vyvolaných stravou po indukcii nádoru Dizertačná práca na získanie akademického titulu doktor medicíny (Dr. med.), Predložená Dorle Knauf na Lekárskej fakulte Univerzity Martina Luthera v Halle-Wittenbergu narodený vo Freibergu (Sasko) Recenzent: 1. Prof. Dr. med. Heike Kielstein 2. PD Dr. med. Hans-Jürgen Seyfarth (Lipsko) 3. Prof. Dr. med. Thoralf Lange (Weißenfes)

buniek

5 ukázal pľúcne metastázy u obéznych zvierat. Tieto spočiatku zistiteľné numerické obmedzenia NK buniek a monocytov by tiež mohli byť zodpovedné za skutočnosť, že osídlenie buniek MADB106 v pľúcach a teda tvorba pľúcnych metastáz u obéznych zvierat je primárne možná a postupuje rýchlejšie.

7 Obsah I Obsah Page 1. Úvod Obezita Tukové tkanivo Vplyv adipokínov na imunitné bunky Nádorové ochorenia spojené s obezitou Cieľ Materiál a metódy Testované zvieratá a chov Experimentálne usporiadanie Model nádoru Injekcia buniek MADB106 alebo NaCl Získanie a analýza materiálu vzorky Odobratie krvi a orgánu Odber lipidov a stanovenie koncentrácie Imunologické testy Izolácia PBMC a lýza erytrocytov podľa Schwinzera Stanovenie počtu PBMC pomocou počítacej komory Neubauer Farbenie špecifických imunitných buniek pomocou protilátok viazaných na fluór chróm Prietokové cytometrické merania pomocou hodnotenia FACS FACS Kvantifikácia NK buniek, nádorových buniek a kontaktov NK bunka-nádorová bunka alebo povrchových metastáz v Pľúcne tkanivo Stanovenie relatívnych koncentrácií mrna v slezinnom tkanive potkanov F344 s normálnou hmotnosťou alebo obezitou pomocou štatistík PCR v reálnom čase 26

8 Obsah II 3. Výsledky Vývoj hmotnosti testovaných zvierat Krátkodobý experiment Dlhodobý experiment Koncentrácie triglyceridov a cholesterolu v pečeni Fluorezens aktivovaný triedič buniek (FACS) - merania v krátkodobom experimente NK bunky B lymfocyty T lymfocyty Cytotoxické (CD8 +) T -Cells T-pomocné bunky (CD4 +) monocyty Fluorezens aktivovaný triedič buniek (FACS) - merania v dlhodobom experimente NK bunky B-lymfocyty T-lymfocyty Cytotoxické (CD8 +) T-bunky T-pomocné bunky (CD4 +) monocyty kvantifikácia NK bunky MADB106 bunky a interakcia NK bunka-nádorová bunka, ako aj povrchové pľúcne metastázy Relatívna koncentrácia mrna aktivujúca a inhibujúca receptory NK buniek a NK bunkovo ​​špecifické cytokíny v tkanive sleziny Relatívna koncentrácia mrna v krátkodobom experimente Relatívna mrna- Koncentrácie v dlhodobom experimente Diskusia Súhrn Bibliografia 58

9 Obsah III 7. Diplomové práce 68 Vyhlásenie o nezávislosti Vyhlásenie o predchádzajúcich doktorandských pokusoch Tabuľkový životopis Poďakovanie

10 Zoznam skratiek IV Zoznam skratiek ANOVA APC BMI CD CFSE CRP DIO FACS FITC IFNγ IL i.v. JAK-STAT KIR MALT MCP-1 MHC MP-NK bunky mrna Ms IgM/G NaCl NKG2D NK bunky PBS PBMC PCR PE analýza odchýlky alophykocyanín index telesnej hmotnosti klaster diferenciácie karboxyfluoresceín sukcínimidylester C-reaktívny proteín Fluorescencia vyvolaná stravou Triedenie aktivovaných buniek Fluoresceín Izotiokyanát Interferón Gama Interleukín intravenózne Januskináza - signálne prevodníky a aktivátory transkripčných zabíjačských buniek Receptory podobné imunoglobulínu S mukozou asociované lymfoidné tkanivo Monocyt Chemotaktický proteín-1 Histokompatibilita Komplex Marginujúce-Pľúcne-Imunoglobulín-Imunoglobulíny-Imunoglobulíny Skupina zabijakov 2, člen D Prírodné zabíjačské bunky Fosfátom pufrovaný soľný roztok Periférna krv mononukleárne bunky Polymeráza reťazová reakcia Fykoeritrín

11 Zoznam skratiek V PE-Cy7 Phycoerithrin-Cyanin 7 PPARγ RPMI Medium SEM Peroxysome Proliferator Activate Receptor-Gamma Roswell Park Memorial Institute Medium Štandardná chyba priemerných TH1/2 T pomocných buniek 1/2 T Reg TNFα WHO T regulátorových buniek - Svetová zdravotnícka organizácia Alzheimerova choroba

32 Tlmočnícke materiály a metódy 21. Nakoniec boli stanovené vlastnosti buniek prezentované vo forme histogramu alebo bodkového diagramu. Týmto spôsobom by bolo možné konkrétnej populácii alebo subpopulácii priradiť viac ako desaťtisíc buniek za menej ako minútu. Obrázok 5: Schematické znázornenie procesu prietokovej cytometrie. Pomocou špeciálnych šošoviek sa bunky analyzujú pomocou dopredu rozptýleného svetla (FSC forward scatter) a bočného rozptýleného svetla (SSC side scatter). Zrkadlá sa použili na zarovnanie svetelných signálov tak, aby ich bolo možné v konečnom dôsledku zachytiť detektormi a previesť ich na signály elektrického napätia. Vyhodnotenie FACS Použitím prietokovej cytometrie sa diferencovaným spôsobom skúmali B a T bunky, NK bunky a monocyty (obr. 6,7). Obrázok 6: Analyzované populácie B, T buniek a monocytov Obrázok 7: Analyzované populácie NK buniek

34 Materiál a metódy 23 cytotoxické T bunky Obrázok 10: Reprezentatívny bodový graf vyfarbenia cytotoxických T buniek alebo T-pomocných buniek; cytotoxické T bunky (CD8a PE +, CD4 PE-Cy7-) v ľavom hornom kvadrante; T pomocné bunky (CD8a PE-, CD4 PE-Cy7 +) v pravom dolnom kvadrante. Obrázok 11: Reprezentatívny bodový graf vyfarbenia monocytov; Monocyty (CD4 PE-Cy7 +, CD3 APC -) NK bunky, nie NK bunky Obrázok 12: Reprezentatívny bodový diagram farbenia NK buniek; NK bunky [CD161a jasný (CD161a PE +, CD3 APC -)] v ľavom hornom kvadrante, bunky iné ako nk [CD161a dim (CD161a PE +, CD3 APC -)] v ľavom dolnom kvadrante. Obrázok 13: PE brána CD161a, minimá 10,1 pre bunky NK (jasný CD3 -/CD161a) a 10 2,2 pre bunky iné ako nk (dimenzia CD3 -/CD161a)

37 Materiál a metódy Štatistika Štatistické hodnotenie sa uskutočňovalo pomocou softvéru GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA). Dáta boli vyhodnotené pomocou testu jednosmernej analýzy odchýlok (ANOVA) a následného Tukeyho viacnásobného porovnávacieho testu. Aby bolo možné určiť všeobecné účinky stravy a nádorových buniek nezávisle od druhého faktora, uskutočnil sa obojsmerný test ANOVA s následným Bonferroniho testom. Limit významnosti pre oba testy bol založený na pravdepodobnosti chyby najviac 5% (P 0,05).

38 Výsledky Výsledky 3.1 Vývoj hmotnosti testovaných zvierat Krátkodobý test Priemerná telesná hmotnosť testovaných zvierat na začiatku testu bola 183,54 gv kontrolnej skupine a 183,76 gv skupine DIO. Potkany, ktoré dostávali normokalorickú kontrolnú stravu počas šiestich týždňov, zvýšili počas tejto doby svoju priemernú hmotnosť o 58% na 290 ± 2,6 g. Naproti tomu zvieratá, ktoré dostávali vysokokalorickú DIO stravu, zvýšili svoju telesnú hmotnosť o 65,5% na priemerných 304 ± 3,9 g (tabuľka 3). V čase injekcie nádorových buniek alebo nosiča NaCI teda zvieratá kŕmené DIO dosiahli významne vyššiu telesnú hmotnosť v porovnaní so zvieratami, ktoré dostali kontrolnú stravu (P = 0,006) (obr. 16). Tab. 3: Vývoj hmotnosti kontrolných a DIO potkanov v krátkodobých experimentálnych týždňoch po začiatku diéty Vývoj hmotnosti 183,54 ± 1,5 212,37 ± 1,6 238,13 ± 2,3 255,2 ± 2,34 268, 34 ± 2,4 284,16 ± 2,75 290,24 ± 2,62 kontrola [g] vývoj hmotnosti DIO [g] 183,76 ± 1,6 227,18 ± 1,79 251,02 ± 2,61 271 0,05 ± 2,79 283,24 ± 3,46 297,47 ± 3,8 304,11 ± 3,88 Sú zobrazené stredné hodnoty a zodpovedajúca štandardná chyba (± SEM); n = 8 potkanov/skupina

40 Výsledky 29 Tabuľka 4: Vývoj hmotnosti kontrolných a DIO potkanov v dlhodobých experimentálnych týždňoch po začiatku diéty Kontrola vývoja hmotnosti [g] 195,53 ± 1,81 222,59 ± 2,17 245,93 ± 2,46 259, 45 ± 2,81 271,8 ± 2,88 284,29 ± 3,08 294,75 ± 3,02 Vývoj hmotnosti DIO [g] 195,53 ± 2,07 227,28 ± 2,47 253,74 ± 3, 33 269,09 ± 3,68 277,51 ± 4,51 294,16 ± 4,14 304,78 ± 4,43 týždňov po začiatku diéty Kontrola prírastku hmotnosti [g] 302,76 ± 3,48 310,51 ± 3, 68 318,04 ± 3,66 329,58 ± 4,09 328,73 ± 4,38 332,49 ± 4,75 332,9 ± 5,47 Prírastok hmotnosti DIO [g] 312,69 ± 4,98 327, 54 ± 5,90 336,25 ± 6,66 351,76 ± 7,21 352,66 ± 7,34 355,67 ± 7,31 367,84 ± 9,19 Sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; n = 8 potkanov/skupina. Prerušovaná čiara pri prechode z 10. na 11. týždeň po začiatku experimentu ilustruje časový okamih injekcie buniek MADB106 alebo NaCl.

41 Výsledky 30 Telesná hmotnosť vg * * * * * * * DIO kontrolná i.v. injekcia týždne po začiatku diéty Obr. 17: Vývoj hmotnosti po 13 týždňoch kŕmenia kontrolnou diétou a DIO diétou. Sú uvedené priemerné hodnoty hmotností všetkých testovaných zvierat (n = 8), ± SEM. Intravenózna injekcia nádorových buniek alebo nosiča (NaCl) sa uskutočnila po 10 týždňoch. Časy, keď sa váhy skupiny DIO významne líšia od hmotnosti kontrolnej skupiny, sú označené znakom *. 3.2 Koncentrácie triglyceridov a cholesterolu v pečeni Koncentrácie triglyceridov a cholesterolu v pečeni boli tiež významne vyššie u potkanov DIO v porovnaní s kontrolnými zvieratami (tab. 5). Tab. 5: Telesná hmotnosť, koncentrácia triglyceridov a cholesterolu v pečeni u kontrolných a DIO zvierat v krátkodobých a dlhodobých experimentoch Krátkodobý experiment Dlhodobý experiment Injekcia MADB106 Injekcia MADB106 21 dní po injekcii MADB106 TG v pečeni (µmol/g) Kontrola 38 ± 8 38 ± 4 DIO 90 ± 15 * 65 ± 9 * Cholesterol v pečeni (µmol/g) Kontrola 6,7 ​​± ± 0,3 DIO 11,0 ± 1,6 * 9,3 ± 0,8 * zobrazené sú priemery ± SEM; n = 8 potkanov/skupina; významné hodnoty označené *, P 0,05; TG = triglyceridy

42 Výsledky FACS - merania v krátkodobom experimente NK bunky Vyhodnotenie počtu NK buniek po krátkej expozícii nádoru počas 15 minút ukázalo významné rozdiely medzi kontrolnými a DIO zvieratami. DIO-kŕmené potkany mali významne menej NK buniek ako kontrolné zvieratá (zobrazené ako% PBMC) ako kontrolné zvieratá (4,3 ± 0,07 oproti 3,95 ± 0,38 (SEM)% PBMC, obr. 18). NK bunky (% PBMC) KoNaCl KoMADB106 * DIONaCl DIOMADB106 Obrázok 18: Kvantitatívne vyhodnotenie počtu NK buniek u samcov potkanov F344 kŕmených obezitou vyvolanou stravou (DIO) alebo kontrolnou stravou (Ko) a 15 minút po podaní MADB106- Injekcia do nádorových buniek (MADB106) alebo NaCl (n = 8); sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; významné rozdiely medzi kontrolnou a DIO skupinou boli označené ako *, P 0,05; PBMC = mononukleárna bunka periférnej krvi.

43 Výsledky B lymfocytov Po krátkej 15-minútovej stimulácii nádorových buniek porovnanie počtu B lymfocytových buniek neodhalilo žiadne významné rozdiely medzi jednotlivými skupinami (obr. 19). B lymfocyty (% PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Obrázok 19: Kvantitatívne hodnotenie B lymfocytov u samcov potkanov F344 kŕmených obezitou vyvolanou stravou (DIO) alebo kontrolnou stravou (Ko) a 15 minút po nádorovej bunke MADB106. - injekcia (MADB106) alebo NaCl (n = 8); sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; PBMC = T lymfocyty mononukleárnych buniek z periférnej krvi Po krátkej 15-minútovej stimulácii nádorových buniek porovnanie počtu T lymfocytov neodhalilo žiadne významné rozdiely medzi jednotlivými skupinami (obr. 20). T lymfocyty (% PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Obrázok 20: Kvantitatívne hodnotenie T lymfocytov u samcov potkanov F344 kŕmených obezitou vyvolanou stravou (DIO) alebo kontrolnou stravou (Ko) a 15 minút po MADB106 nádorovej bunke - injekcia (MADB106) alebo NaCl (n = 8); sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; PBMC = mononukleárna bunka periférnej krvi.

44 Výsledky Cytotoxické (CD8 +) T bunky Po krátkej 15-minútovej stimulácii nádorových buniek neboli medzi jednotlivými skupinami významné rozdiely v počte cytotoxických (CD8 +) T-buniek (obr. 21). 45 Cytotoxické T bunky (% T lymfocytov) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Obrázok 21: Kvantitatívne hodnotenie cytotoxických T buniek (CD8 +) u samcov potkanov F344 kŕmených obezitou vyvolanou stravou (DIO) alebo kontrolnou stravou (Ko ) a 15 minút po injekcii MADB106 nádorových buniek (MADB106) alebo NaCI (n = 8); sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; PBMC = pomocné bunky T mononukleárnych buniek z periférnej krvi (CD4 +) Medzi jednotlivými skupinami neboli významné rozdiely pri porovnaní počtu pomocných buniek T (CD4 + T lymfocytov) po krátkej stimulácii nádorových buniek 15 minút (obr. 22) ). 75 pomocných buniek T (% T lymfocytov) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Obrázok 22: Kvantitatívne hodnotenie pomocných buniek T (CD4 +) u samcov potkanov F344 kŕmených obezitou vyvolanou stravou (DIO) alebo kontrolnou stravou (Ko) a 15 minút po injekcii MADB106 nádorových buniek (MADB106) alebo NaCI (n = 8); sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; PBMC = mononukleárna bunka periférnej krvi.

45 Výsledky Monocyty Pri porovnaní počtu monocytových buniek normálnych a obéznych kontrolných zvierat, ktorým bol injikovaný NaCI, boli významné rozdiely. V porovnaní s obéznymi kontrolnými zvieratami mali kontrolné zvieratá s normálnou hmotnosťou významne vyšší počet monocytov, na základe PBMC v periférnej krvi. Porovnanie zvierat s normálnou hmotnosťou a obéznych nádorov, ako aj porovnanie DIO a kontrolných skupín, neodhalilo žiadne významné rozdiely (obr. 23). Monocyty (% PBMC) KoNaCl * DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Obrázok 23: Kvantitatívne hodnotenie monocytov u samcov potkanov F344 kŕmených obezitou vyvolanou stravou (DIO) alebo kontrolnou stravou (Ko) a 15 minút po injekcii nádorových buniek MADB106 ( MADB106) alebo NaCl (n = 8); sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; významné rozdiely medzi skupinami označenými *, P 0,05; PBMC = mononukleárna bunka periférnej krvi.

46 Výsledky FACS - merania v dlhodobom experimente NK bunky Pri porovnaní percentuálneho podielu NK buniek v PBMC tri týždne po injekcii MADB106 neboli medzi jednotlivými skupinami významné rozdiely (obr. 24). 4 NK bunky% PBMC KoNaCl KoMADB106 DIONaCl DIOMADB106 Obrázok 24: Kvantitatívne vyhodnotenie počtu NK buniek u samcov potkanov F344 kŕmených obezitou vyvolanou stravou (DIO) alebo kontrolnou stravou (Ko) a tri týždne po počte nádorových buniek MADB106. Injekcia (MADB106) alebo NaCl (n = 8); sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; PBMC = B lymfocyty mononukleárnych buniek periférnej krvi Ani tri týždne po injekcii buniek MADB106 neodhalilo vyhodnotenie počtu B lymfocytových buniek žiadne významné rozdiely medzi jednotlivými skupinami (obr. 25). B lymfocyty (% PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Obrázok 25: Kvantitatívne vyhodnotenie B lymfocytov u samcov potkanov F344 kŕmených obezitou vyvolanou stravou (DIO) alebo kontrolnou stravou (Ko) a tri týždne po nádorovej bunke MADB106. - injekcia (MADB106) alebo NaCl (n = 8); sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; PBMC = mononukleárna bunka periférnej krvi.

47 Výsledky T lymfocyty Tri týždne po injekcii nádorových buniek neboli medzi jednotlivými skupinami významné rozdiely, pokiaľ ide o percento T lymfocytov v PBMC (obr. 26). T lymfocyty (% PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Obrázok 26: Kvantitatívne hodnotenie T lymfocytov u samcov potkanov F344 kŕmených obezitou vyvolanou stravou (DIO) alebo kontrolnou stravou (Ko) a tri týždne po nádorovej bunke MADB106. - injekcia (MADB106) alebo NaCl (n = 8); sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; PBMC = cytotoxické (CD8 +) T bunky mononukleárnych buniek v periférnej krvi Vyhodnotenie počtu buniek cytotoxických (CD8 +) T buniek po 3 týždňoch rastu nádoru neodhalilo významné rozdiely medzi jednotlivými skupinami (obr. 27). 45 Cytotoxické T bunky (% T lymfocytov) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Obrázok 27: Kvantitatívne hodnotenie cytotoxických T buniek (CD8 +) u samcov potkanov F344 kŕmených obezitou vyvolanou stravou (DIO) alebo kontrolnou stravou (Ko ) a tri týždne po injekcii nádorových buniek MADB106 (MADB106) alebo NaCl (n = 8); sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; PBMC = mononukleárna bunka periférnej krvi.

48 Výsledky T pomocné bunky (CD4 +) Porovnanie počtu buniek T pomocných buniek (CD4 +) po 3 týždňoch rastu nádoru neodhalilo žiadne významné rozdiely medzi jednotlivými skupinami (obr. 28). 70 pomocných buniek T (% T-lymfocytov) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Obrázok 28: Kvantitatívne hodnotenie pomocných buniek T (CD4 +) u samcov potkanov F344 kŕmených obezitou vyvolanou stravou (DIO) alebo kontrolnou stravou (Ko) a tri týždne po injekcii nádorových buniek MADB106 (MADB106) alebo NaCl (n = 8); sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; PBMC = mononukleárne bunkové monocyty z periférnej krvi Po 3 týždňoch rastu nádoru porovnanie počtu monocytov neodhalilo žiadne významné rozdiely medzi jednotlivými skupinami (obr. 29). Monocyty (% PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Obrázok 29: Kvantitatívne hodnotenie monocytov u samcov potkanov F344 kŕmených obezitou vyvolanou stravou (DIO) alebo kontrolnou stravou (Ko) a tri týždne po injekcii nádorových buniek MADB106 (MADB106) ) alebo NaCl (n = 8); sú uvedené priemerné hodnoty ± SEM; PBMC = mononukleárna bunka periférnej krvi.