TECHNICKÁ UNIVERZITA MNÍCHOV - PDF na stiahnutie zadarmo

Klinika a poliklinika traumatologickej kliniky TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN kliniky rechts der Isar Vyradená myš MDR 2 ako model pečeňovej osteodystrofie Andrea Schmid Kompletná kópia dizertačnej práce schválená Lekárskou fakultou Technickej univerzity v Mníchove na získanie akademického titulu doktor medicíny Predseda: Univ.-Prof. DR. E. J. Rummeny Recenzent dizertačnej práce: 1. prihláška prof. Dr. A. K. Nüssler, Eberhard-Karls University v Tübingene 2. Univ.-Prof. DR. R. von Eisenhart-Rothe Dizertačná práca bola predložená na Technickú univerzitu v Mníchove 31. júla 2012 a prijatá lekárskou fakultou 13. novembra 2013.

univerzita

Obsah Obsah Zoznam skratiek 1 Úvod 1 1.1 Všeobecný úvod 1 1.2 Pečeň 1 1.2.1 Histologická štruktúra pečene 1 1.2.2 Fyziologické funkcie pečene 2 1.2.3 Patofyziológia pečene 3 1.3 Kosti 4 1.3.1 Štruktúra kostí, štruktúra kostí a bunky 4 1.3.2 Remodelácia a fyziologické úlohy kostí 5 1.3.3 Nerovnováha kostného metabolizmu 6 1.4 Situácia štúdie 7 1.4.1 Zmeny kostí pri chronických ochoreniach pečene 7 1.4.2 Reverzibilita pečeňovej osteodystrofie 8 1.5 Metabolizmus vitamínu D 10 1.6 Úloha TGF-β v pečeni a metabolizmus kostí 11 1.7 Alternatívny zvierací model 13 1.8 Výskumná otázka 14 2 Materiál a metódy 15 2.1 Dizajn štúdie 15 2.2 Testované zvieratá 16 2.2.1 Kmene myší 16 2.2.2 Príprava prípravku 17

Obsah 2.2.2.1 Materiál 17 2.2.2.2 Metóda 17 2.3 Histológia 18 2.3.1 Histotechnológia 18 2.3.1.1 Fixácia vzoriek pečeňového tkaniva 18 2.3.1.1.1 Materiál 18 2.3.1.1.2 Princíp 18 2.3.1.1.3 Vykonanie fixácie tkaniva 18 2.3 .1.2 Dehydratácia a zabudovanie vzoriek pečeňového tkaniva 18 2.3.1.2.1 Materiál a vybavenie 18 2.3.1.2.2 Princíp dehydratácie a zabudovania 19 2.3.1.2.3 Vykonanie dehydratácie a zabudovanie 19 2.3.1.3 Výroba parafínových častí 19 2.3. 1.3.1 Materiál a vybavenie 19 2.3.1.3.2 Princíp prípravy sekcií 20 2.3.1.3.3 Postup 20 2.3.1.4 Hematoxylín-eozínové farbenie a montáž 20 2.3.1.4.1 Materiál 20 2.3.1.4.2 Princíp hematoxylínu Farbenie eozínom 21 2.3.1.4.3 Vykonanie farbenia 21 2.3.1.5 Masson-Goldnerovo trichrómové farbenie a montáž 23 2.3.1.5.1 Materiál a vybavenie 23 2.3.1.5.2 Princíp Masson-Goldnerovho trichrómového farbenia 24 2.3. 1.5.3 Vykonanie farbenia 24 2.3.2 Svetelné mikroskopické vyhodnotenie pečeňových rezov Prípravy 27 2.3.2.1 Zariadenia a softvér 27 2.3.2.2 Princíp mikroskopického hodnotenia pomocou svetla 27

Obsah 2.3.2.3 Vykonanie svetelného mikroskopického hodnotenia 27 2.4 Stanovenie a vyhodnotenie hodnôt v krvnom sére 28 2.4.1 Stanovenie aktivity enzýmu 28 2.4.1.1 Materiál, vybavenie a softvér 28 2.4.1.2 Princíp stanovenia aktivity enzýmu 29 2.4.1.3 Vykonanie stanovenia aktivity enzýmu 29 2.4.2 TGF-β - Stanovenie koncentrácie 31 2.4.2.1 Materiál, prístroje a softvér 31 2.4.2.2 Princíp 32 2.4.2.3 Vykonanie stanovenia koncentrácie TGF-β 32 2.5 Merania Micro-CT 35 2.5.1 Zariadenie a softvér 35 2.5.2 Princíp merania μct 35 2.5 .3 Meranie μct 35 2.5.4 Popísané kostné parametre 36 2.6 Kvantifikácia génovej expresie v pečeni a kostnom tkanive 36 2.6.1 Izolácia RNA z pečene a kostného tkaniva 36 2.6.1.1 Materiál, vybavenie a softvér 36 2.6.1.2 Princíp RNA Izolácia 37 2.6.1.3 Izolácia RNA 38 2.6.2 Doplnková syntéza DNA (cdna) 40 2.6.2.1 Materiál a vybavenie 40 2.6.2.2 Princíp syntézy cdna 40 2.6.2.3 Vykonanie g syntézy cdna 41 2.6.3 amplifikácia cdna pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a elektroforetickej separácie DNA 41 2.6.3.1 materiál, vybavenie a softvér 41

Obsah 2.6.3.2 Princíp PCR a gélovej elektroforézy 42 2.6.3.3 Vykonávanie PCR a gélovej elektroforézy 43 2.6.3.4 Použité primery 44 2.6.4 Denzitometrické hodnotenie génovej expresie 46 2.6.4.1 Softvér 46 2.6.4.2 Princíp a vykonávanie denzitometrického hodnotenia 46 2.7 Štatistické Vyhodnotenie 46 2.7.1 Softvér 46 2.7.2 Vykonanie štatistického vyhodnotenia 46 3 Výsledky 47 3.1 Histologické vyhodnotenie pečeňového tkaniva v priebehu času 47 3.2 Zvýšené hladiny transamináz a dehydrogenázy v krvnom sére myší MDR2 -/- 51 3.2.1 Aktivita enzýmu LDH 51 3.2. 2 Aktivita enzýmu ASAT 52 3.2.3 Aktivita enzýmu ALAT 53 3.3 Zmenená kostná architektúra u myší MDR2 -/- 54 3.3.1 Kortikálna kostná architektúra 54 3.3.2 Spongiózna kostná architektúra 56 3.4 Chronicky zvýšené sérové ​​hladiny TGF-β u myší MDR2 -/- 60 3,5 Znížená expresia kostných markerov u staršie myši MDR2 -/- 61 3.5.1 expresia OPN v pečeňovom tkanive 62 3.5.2 expresia osteokalcínu v pečeňovom tkanive 63 3.5.3 Expresia OPG v tkanive pečene 64 3.5.4 Expresia OPN v kostnom tkanive 65 3.5.5 Expresia osteokalcínu v kostnom tkanive 66

Obsah 3.6 Génová expresia pečeňového tkaniva enzýmov a proteínov, ktoré regulujú metabolizmus vitamínu D 67 4 Diskusia 69 4.1 Obmedzenie a výhľad 77 5 Zhrnutie 80 6 Zoznam obrázkov 82 7 Zoznam tabuliek 83 8 Bibliografia 84 9 Dodatok 94 9.1 Optimalizácia farbenia 94 9.1.1 HE farbenie 94 9.1.2 MGT Farbenie 95 9.2 Ďalšie histologické obrazy 96 9.3 Ďalšie informácie o použitých priméroch 98 9.3.1 β-aktín 98 9.3.2 Osteokalcín 100 9.3.3 Osteopontín 105 9.3.4 Osteoprotegerín 107 9.3.5 MDR2 111 10 Poďakovanie 117

Zoznam skratiek 25 (OH) D 3 25-Hydroxycholekalciferol 1,25 (OH) 2 D 3 1α, 25-Dihydroxycholekalciferol PBC PBS PCR ph PSC PTH RANKL RNA RT RT-PCR sec SMI Taq TBE Tb.N Tb.Sp Tb.Th TGF -β TRAP TV ao UV V VDBP napr. primárna biliárna cirhóza fosfátom pufrovaný soľný roztok polymerázová reťazová reakcia pondus hydrogenii primárna sklerotizácia cholangitída aktivátor paratyroidného hormónu receptor pre nukleárny faktor κ B liga ribonukleová kyselina izbová teplota reverzná transkriptáza polymerázová reťazová reakcia druhá Štruktúrny modelový index Thermophilus aquaticus Tris-borát/EDTA trabekulárne číslo Trabekulárna separácia kostí β-celkové množstvo trabekulárnej kosti vrátane napríklad proteínu viažuceho vitamín D ultrafialového žiarenia

1 Úvod 13 Obr. 1-5 Hypotetický regulačný mechanizmus pečeňovej osteodystrofie TGF-β ako možný regulátor Grafické zdroje: http://www.servier.de/medicalart/skelett-und-knochen/?catselect=5; http://www.servier.de/medicalart/ arterien-physiologische /? catselect = 0; http://www.servier.de/medicalart/verdauungssystem/?catselect=7; 5. augusta 2011 1.7 Alternatívny zvierací model Celkovo neexistujú presne vykonané dlhodobé štúdie in vivo týkajúce sa hepatálnej osteopatie. V takom prípade je populácia pacientov (typ, trvanie, štádium ochorenia pečene; vek, pohlavie, komorbidity).

2 Materiál a metódy 22 1. Odparafínovanie Roticlear I 3 min Roticlear II Roticlear III 2 min 2 min Roticlear IV 2 min Roticlear V 2 min 2. Rehydratácia 99,9% EtOH I 3 min 99,9% EtOH II 3 min 99,9 % EtOH III 2 min. 90% EtOH 2 min. 80% EtOH 2 min., Tj. 2 O 2 min. 3. farbenie, roztok hemalu kyslý podľa Mayera, 5 min. Tečúca voda z vodovodu, 15 min. Roztok eozínu G, 0,5%, vodný roztok, 3 min., Tj. 2 O krátko 4. Dehydratácia 80% EtOH 30 s 90% EtOH I 4 min 90% EtOH II 4 min 99,9% EtOH I 3 min 99,9% EtOH II 5 min 5. Čistý Roticlear I 3 min Roticlear II Roticlear III Roticlear IV Roticlear V 4 min. 5 min. 5 min. 3 min. Tabuľka 2-2 Protokol farbenia hematoxylínom a eozínom sek. sekundy. Výsledky farbenia sú modrofialové bunkové jadrá, bledočervená cytoplazma, červené svalové vlákna, červenooranžové erytrocyty a červené kolagénové spojivové tkanivo (pozri obr. 2-1). ).

2 Materiál a metódy 23 Obr. 2-1 Príklad farbenia pečene hematoxylínom, samičky myší MDR2 -/-, týždeň života 5 2.3.1.5 Farbenie a montáž trichrómu Masson-Goldner 2.3.1.5.1 Materiál a vybavenie Rotipuran 100% kyselina octová pa ROTH (Kat. Č .: 3738,4) EtOH 99,9%, 90%, 80%, 70% roztok hematoxylínu A podľa Weigerta Roztok hematoxylínu B podľa Weigert Apotheke des MRI ROTH (katalógové číslo: X906,1) ROTH (kat. Č.: X907.1) Svetlozelená SF žltkastá MERCK (kat. Číslo: 115941) oranžová G MERCK (kat. Číslo: 115925) Poncau xylidín FLUKA Chemie GmbH (kat. Číslo: 81465) Kyselina fuchsín FLUKA Chemie GmbH (kat. Č.: 84600) Hydrát kyseliny tungstofosforečnej kryštalicky najčistejší MERCK (katalógové číslo: 100582) Roticlear ROTH (katalógové číslo: A538) rozsah magnetickej tyčinky magnetické miešadlo MR Hei-Mix L analytické váhy ROTH (katalógové číslo: C267.1) Heidolph Instruments, D-Schwabach Kern a Son GmbH, D-Balingen

2 Materiál a metódy 25 3. Kyselina fuchsín-ponceau xylidíny 0,2 g (g) Ponceau xylidíny 0,1 g kyselina fuchsín 300 ml ddh 2 O 0,6 ml 1% kyselina octová 4. Kyselina fosfovolfrámová oranžová G 12 g kyselina wolframofosforečná 3 g oranžová G 200 ml ddh 2 O 5. svetlozelená 0,3 g svetlozelená SF žltkastá 200 ml ddh20 0,4 ml 1% kyseliny octovej Uvedené sfarbenie bolo vykonané podľa protokolu vyvinutého pomocou optimalizácie farieb (pozri kapitolu 9.1 nižšie) (pozri tabuľku 2-3) . Zafarbené, odvodnené a vyčistené rezy boli potom pokryté Roti-Histokitt II rovnakým spôsobom ako rezy zafarbené HE. Zmes hematoxylínu A a B podľa Weigerta sa môže uchovávať maximálne 8 dní pri izbovej teplote. Výsledkom zafarbenia sú čiernohnedé bunkové jadrá, červená cytoplazma, svetločervené svalové vlákna, oranžovočervené erytrocyty a zelené kolagénne spojivové tkanivo (pozri obr. 2-2). Obr. 2-2 Príklad Masson-Goldnerovho farbenia trichrómovej pečene, samica myši MDR2 -/-, vek 44. týždeň

2 Materiál a metódy 26 1. Odparafínovanie Roticlear I 3 min Roticlear II Roticlear III 2 min 2 min Roticlear IV 2 min Roticlear V 2 min 2. Rehydratácia 99,9% EtOH I 3 min 99,9% EtOH II 3 min 99,9 % EtOH III 2 min 90% EtOH 2 min 80% EtOH 2 min 3. farbenie hematoxylínu podľa Weigerta 4 min tečúca voda z vodovodu 10 min kyslé fuchsín-Ponceau-xylidíny 2-4 min 1% kyselina octová krátka Kyselina fosfowolfrámová oranžová G 5 min 1% kyselina octová krátka Svetlozelená 15 min 1% kyselina octová 2 min 4. Dehydratácia 80% EtOH 30 s 90% EtOH I 4 min 90% EtOH II 4 min 99,9% EtOH I 3 min 99,9% EtOH II 5 min 5. Číry Roticlear I 3 min. Roticlear II Roticlear III Roticlear IV Roticlear V 4 min. 5 min. 5 min. 3 min. Tabuľka 2-3 Protokol Masson-Goldnerovo trichrómové farbenie

2 Materiály a metódy 28 Hematoxylin-Eosin Masson-Goldner Tri. Fáza I plus 0 LRMCLRMC periduktálne depozitá v spojivovom tkanive 1-3 edém 1 portálny zápalový infiltrát 1 stupeň II plus 5 proliferácia žlčovodov 1 periportálny zápalový infiltrát 1 portálno-periportálna fibróza 1-5 nekróza jedlom 1 stupeň III plus 13 atrofia žlčovodov 1 nekróza panvy IV plus 18 zriedenie žlčových ciest 1 Biliárna cirhóza 1 Výsledok Tabuľka 2-4 Skóre histologického hodnotenia 2.4 Stanovenie a vyhodnotenie hodnôt v krvnom sére 2.4.1 Stanovenie aktivity enzýmu 2.4.1.1 Materiál, vybavenie a softvér Testovacia súprava Fluitest LDH-L ANALYTICON Biotechnologies (kat. Č .: 2222) ) Fluitest GOT/ASAT ANALYTICON Biotechnologies (katalógové číslo: 1176) Fluitest GPT/ALAT ANALYTICON Biotechnologies (katalógové číslo: 1186) LDH-štandard 0: NobiCalserum Multi Nobis/HITADO

de/min 2 Materiál a metódy 31 zmien absorbancie vytvorených za min. Tieto stredné hodnoty boli vynesené do bodkového diagramu na súradnici proti známym enzýmovým aktivitám podľa štandardu na úsečke. Potom sa vypočítala lineárna najlepšie vyhovujúca čiara bodového diagramu, ako aj funkcia, ktorá ju popisuje, a jej koeficient určenia. Nameraná hodnota pre štandard 8 zodpovedala slepej hodnote. Vypočítaná funkcia bola k dispozícii v nasledujúcom tvare: Po vyriešení vzorca pre x sa pre y použila perióda 0 min až x min každej vzorky séra. Takto určené hodnoty x zodpovedali enzýmovej aktivite vzorky séra korigovanej na slepú hodnotu a boli prenesené do tabuliek Microsoft Excel, štatisticky vyhodnotené pomocou GraphPad Prism a zobrazené graficky. 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0-0,05 Štandardná krivka LDH y = ​​0,0027x - 0,0213 R² = 0,9987 0 20 40 60 80 100 120 140 Aktivita enzýmu [U/l] Obr. 2-3 Príklad štandardnej krivky LDH fotometrické hodnotenie štandardných roztokov LDH vrátane štandardov 3-7 2.4.2 Stanovenie koncentrácie TGF-β 2.4.2.1 Materiál, vybavenie a softvér Rekombinantný ľudský TGF-β 1 peprotech ( Kat. Číslo: 100-21) Dulbecco s PBS (1) PAA Laboratories GmbH (kat. Č .: H15-002)

de/min. 2 Materiál a metódy 34 Priradenie zvýšenia extinkcie za minútu konkrétnej koncentrácii TGF-p sa uskutočnilo pomocou štandardnej krivky (pozri obr. 2-4). Na tento účel boli stredné hodnoty štandardu oproti známym koncentráciám TGF-pi na štandard vynesené na úsečku v bodovom diagrame na súradnici. Vypočítala sa lineárna regresná priamka bodového diagramu, ako aj funkcia, ktorá ju popisuje, a jej koeficient stanovenia, pričom hodnota nameraná pre štandard 8 zodpovedala slepej hodnote. Vypočítaná funkcia bola k dispozícii v nasledujúcom tvare: Štandardná krivka TGF-β 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 y = 0,0033x + 0,0325 R² = 0,9803 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Koncentrácia [ng/ml] Obr. 2-4 TGF-β štandardná krivka fotometrické hodnotenie štandardných roztokov TGF-β Po vyriešení vzorca pre x, časové obdobie 0 min použité až x min každej vzorky séra. Takto určené hodnoty x zodpovedali koncentráciám TGF-β vo vzorke séra korigovaným na slepú hodnotu a boli prenesené do tabuliek programu Microsoft Excel, štatisticky vyhodnotené pomocou GraphPad Prism a zobrazené graficky.

2 Materiál a metódy 42 EtBr Glycerol SIGMA (katalógové číslo: E1385-5ML) SIGMA (katalógové číslo: G8773-500ML) peqgold Universal Agarose Peqlab (katalógové číslo: 35-1020) puc19-marker ROTH (kat. Č.: X901.1) Taq-polymeráza 1 000 U Axon Labortechnik (katalógové číslo: 22466) Taq-polymerázový reakčný pufor 10 BD MgCL 2 dntp-zmes 10 mm na nukleotid Axon Labortechnik (kat. Číslo: 24478) Tris (hydroxymetyl) ) aminometán Mastercycler ep gradient PowerPac TM HC Napájací gél ix Imager SIGMA (katalógové číslo: T87602-3KG) Eppendorf AG, D-Hamburg Bio-Rad Laboratories GmbH, D-Munich Intas Science Imaging Instruments GmbH, D-Göttingen Intas Steuer Softvér na získavanie obrázkov Intas Science Imaging Instruments GmbH, D-Göttingen 2.6.3.2 Princíp PCR a gélová elektroforéza PCR je metóda, ktorá umožňuje selektívne amplifikovať určité časti DNA in vitro. Za týmto účelom skúmavky naplnené cdna a reakčná zmes prechádzajú 40 cyklami v zariadení, ako je gradient Mastercycler ep. Každý cyklus pozostáva z 3 krokov: 1. Denaturácia Pri 95 ° C sú existujúce H-väzby medzi vláknami DNA alebo primérmi prerušené, takže zostanú iba jednotlivé vlákna. Počas inicializácie sa tento krok predĺži o 5 minút, aby sa odpojilo čo najviac reťazcov.