Vinylchlorid a strava s vysokým obsahom tukov ako model protokolu interakcie prostredia a obezity
Zhrnutie
Cieľom tohto protokolu bolo vyvinúť myší model toxickej expozície na nízkej úrovni, ktorý nespôsobuje zjavné poškodenie pečene, ale skôr zhoršuje už existujúce poškodenie pečene. Táto paradigma lepšie rekapituluje expozíciu človeka a jemné zmeny, ku ktorým dochádza pri vystavení toxickým koncentráciám, ktoré sa považujú za bezpečné.
Abstrakt
Vinylchlorid (VC), hojný znečisťovateľ životného prostredia, spôsobuje vysoké hladiny steatohepatitídy, ale pri nízkych koncentráciách sa považuje za bezpečný. Aj keď niekoľko štúdií skúmalo úlohu VC ako priameho hepatoxického činidla, koncept, že VC zvyšuje citlivosť pečene na ďalšie faktory, ako je nealkoholická tuková pečeň (NAFLD) spôsobená stravou s vysokým obsahom tukov (HFD), je nový. Tento protokol popisuje paradigmu expozície na hodnotenie účinkov chronickej nízkej expozície VC. Myši sú očkované na diéte s nízkym obsahom tuku alebo s vysokým obsahom tukov jeden týždeň pred začiatkom inhalačnej expozície a zostávajú na tejto diéte počas celého experimentu. Myši sú VC (úroveň pod OSHA:
Úvod
Hlavnou cestou expozície mnohých toxínov a znečisťujúcich látok v životnom prostredí je inhalácia. Po inhalácii môže zlúčenina vstúpiť do systémového obehu pľúcami, vstúpiť do pečene a pred vylučovaním 14, 15, 16 sa metabolicky aktivovať pečeňovými enzýmami. Často sú to tieto aktívne metabolity, ktoré spôsobujú toxicitu a poškodenie tela. Predchádzajúce štúdie tejto skupiny a ďalších používali metabolity VC ako náhrady expozície plynom VC 17, 18. Iné skupiny použili inhalačné modely VC; na vyvolanie akútnej toxicity, závažného poškodenia pečene a vývoja nádoru sa však implementovali extrémne vysoké úrovne expozície (> 50 ppm) 19. Aj keď tieto štúdie poskytli dôležité informácie a mechanizmy karcinogenity vyvolanej VC, ne rekapitulujú jemné účinky a zložité interakcie s ďalšími prispievajúcimi faktormi, a preto sú pre expozíciu človeka menej relevantné.
Tu popísaný model VC inhalácie plus High Fat Eat (HFD) (pozri obrázok 1) pre časovú os) je prvý model chronickej nízkodávkovej expozície VC (t.j. sub-OSHA koncentrácia), pri ktorej sú myši vystavené toxínu za podmienok, ktoré oveľa viac napodobňujú expozíciu človeka. Údaje z tohto modelu skutočne rekapitulovali výsledky pozorované u ľudí s VC, ako sú účinky na metabolické cesty 20, oxidačný stres a mitochondriálna dysfunkcia 4. Ostatné modely inhalácie myší, ako napr B. Modely hlavy a nosa 21 vyžadujú, aby bolo zviera pripútané, čo by pre zviera bolo stresujúce. Táto metóda expozície celého tela tu nevyžaduje žiadne injekcie ani zbytočný stres pre zvieratá. Zvieratá majú ad libitum prístup k potrave a vode a sú umiestnené vo väčšej inhalačnej komore na určitý počet hodín denne a deň v týždni. Okrem toho je koncepcia, že VC mení citlivosť na iné hepatotoxické látky, novým objavom, ktorý prvýkrát zistila táto skupina 12 a ktorý má vplyv na expozíciu VC pri koncentráciách hlboko pod koncentráciami pre priamu hepatotoxicitu požadované sú.
Túto metódu inhalačnej expozície možno použiť na napodobnenie expozície širokej škále plynných toxínov v našom prostredí vrátane ďalších prchavých organických zlúčenín. Prchavé organické zlúčeniny skutočne tvoria veľkú skupinu látok znečisťujúcich životné prostredie a sú rozšírenejšie v priemyselných oblastiach, čo zvyšuje riziko chronickej expozície u určitých populácií22. Tento protokol je možné prispôsobiť rôznym experimentálnym otázkam. Trvanie a koncentrácia podávanej zlúčeniny sa môže meniť. Aj keď boli pôvodne vyvinuté na stanovenie poškodenia pečene, pomocou tohto modelu môžu a boli skúmané ďalšie orgánové systémy 23. Tento model by mali zvážiť výskumníci, ktorí študujú chronické expozície zvierat, ale chcú minimalizovať stres zvierat.
Protokol
Všetky experimenty na zvieratách/VC boli schválené ministerstvom životného prostredia, Asociáciou bezpečnosti pre hodnotenie a akreditáciu starostlivosti o laboratórne zvieratá a postupy boli schválené miestnym inštitucionálnym výborom pre starostlivosť a použitie zvierat.
1. Experimentálne nastavenie a aklimatizácia na vyčistené experimentálne diéty
POZNÁMKA: Existuje niekoľko komerčne dostupných inhalačných expozičných systémov, od expozície celého tela iba nosom, od manuálnych po automatizované systémy. Údaje, ktoré predtým publikovala táto skupina, boli odvodené z holistického manuálneho systému 12, 23, 24. Obrázok 2Obrázok 3 zobrazuje diagram popisujúci automatizovaný systém inhalácie.
4. Expozičná klietka a príprava zvierat
- Vyberte myši z ich krycích komôr a umiestnite ich do jednotlivých klietok klietky v inhalačnej komore (jeden držiak klietky pre kontrolné myši, druhý pre exponované myši). Náhodne umiestnite každú myš do klietkového stojana každý deň, aby ste sa uistili, že je každá myš homogénne exponovaná v expozičnej komore. Do laboratórneho zošita si poznačte počet a polohu klietky každého zvieraťa.
- Umiestnite každý klietkový regál do príslušnej komory a zatvorte dvere komory.
5. Vykonanie expozície
- Otočte kohútik na ventile pre plynovú nádrž VC do zatvorenej polohy a vypnite všetky prúdy vzduchu v expozičnej komore. Otáčajte rotametrom, kým cez riadiacu komoru neprúdi vzduch.
- Odstráňte dvere z každej komory, aby ste myši ventilovali. Odstráňte podpery klietky z komôr. Vyberte myši s kapucňou z ich expozičných klietok a vložte ich späť do ich klietok. Prepravte všetky myši späť do ich obývacích priestorov na nocľah v bežných klietkach.
- Zlikvidujte všetok odpad z nádoby na exkrementy do nádoby na biologické nebezpečenstvo schválenej Ministerstvom životného prostredia a bezpečnosti (DEHS), pretože to môže byť považované za chemické nebezpečenstvo zo strany ústavných zdravotníckych služieb. Vyčistite dvere komory, vylučovací podnos, expozičnú klietku a expozičnú komoru pre experimentálne a kontrolné systémy.
7. Validácia koncentrácie VC v komorách počas expozície
8. Ukončenie experimentu s inhalačnou expozíciou
POZNÁMKA: Podľa požadovaného času expozície, napr. B. 6, 8 a/alebo 12 týždňov po začiatku inhalačnej expozície sa experimenty ukončia a zvieratá sa usmrtia (pozri obrázok 1) pre časovú os).
Reprezentatívne výsledky
V priebehu experimentu sa týždenne sledovala telesná hmotnosť zvierat a spotreba potravy, aby sa zaistilo zdravie zvierat a vyhodnotil sa metabolizmus in vivo. Obrázok 3A. ukazuje telesnú hmotnosť a spotrebu potravy pre 12-týždňový experiment. Telesné hmotnosti sa merali raz týždenne a spotreba potravy dvakrát týždenne pre všetky skupiny. Všetky myši v priebehu štúdie pribrali. Zatiaľ čo myši v HFD skupinách priberali väčšiu váhu ako myši v LFD skupinách, ako sa očakávalo, myši vystavené VC nepriberali väčšiu váhu ako myši v príslušnej kontrolnej skupine. Spotreba potravy sa nelíšila vo všetkých skupinách 12, 24.
Obrázok 3B. ukazuje reprezentatívne fotomikroskopy pečeňových rezov zafarbených H&E na analýzu všeobecnej morfológie. V skupine s LFD nespôsoboval VC žiadne abnormálne patologické zmeny. HFD kŕmenie významne zvýšilo steatózu (hromadenie tuku) a expozícia VC tento efekt zvýšila. Expozícia VC mala navyše za následok vznik niektorých zápalových hotspotov v skupine HFD 12, 24 .
Hladiny plazmatickej transaminázy (ALT a AST) sa merali ako indikátory poškodenia pečene a zvýšené hladiny transamináz sú indikátorom poškodenia pečene. V skupine s LFD sa transamináza nezvyšovala s VC. Samotný HFD mierne zvýšil hladiny transamináz a predovšetkým VC tento efekt významne zlepšil (obrázok 3C.) 12, 24 .
Pomery hmotnosti pečene a telesnej hmotnosti boli vypočítané pre každú skupinu. HFD významne zvýšil pomer pečene a telesnej hmotnosti. VC však tento účinok významne nezvýšil (obrázok 3D.) 12 .
Diskusia
Tento model NAFLD so zosilneným VC je novou metódou na hodnotenie účinku medznej expozície VC pod OSHA v paradigme inhalácie celého tela. Tento model umožňuje výskumníkom študovať subhepatotoxické a senzibilizujúce účinky iba pri nízkych hladinách VC. Tento model koexpozície v skutočnosti dosahuje zlepšenie poškodenia pečene, zvýšenie plazmatických ALT a AST a mierny zápal, zatiaľ čo pri tejto koncentrácii do značnej miery neovplyvňuje iné orgánové systémy, napríklad srdce. Tento chronický model vyžaduje inhalačné komory celého tela, ale minimalizuje hladinu stresu a expozície. Aj keď tu uvedený protokol predstavuje softvérový prístup, naše skúsenosti ukazujú, že manuálny prístup je tiež presnou a konzistentnou metódou expozície 12, 24. Okrem toho je ľahko použiteľný na niekoľko výskumných oblastí vrátane poškodenia iných orgánov 23 spôsobeného vystavením prchavým organickým zlúčeninám 22. Tento model môže predovšetkým viac pripomínať patogenézu spoločného vystavenia človeka účinkom chemických látok v prostredí a základné ochorenie 5 .
Na dosiahnutie podobných výsledkov je potrebné dosiahnuť určité kritické kroky pri optimalizácii protokolu. Posudzovatelia musia napríklad určiť, že koncentrácia VC alebo iného toxického činidla v komorách je v požadovanom rozmedzí expozície (t. J. Nízke, sub-OSHA alebo akútne hladiny). Optimalizácia tohto kroku inhalačnej komory je rozhodujúca pre úspešný expozičný model pre človeka. Po druhé, je možné zmeniť aj nastavenie času expozície za deň a trvania experimentu. V súlade so záujmami tejto skupiny sa dosiahlo nastavenie expozície na pracovisku a skúmal sa aj ďalší parameter výživy. Týmto protokolom sa však dajú modelovať aj environmentálne a akútne expozície.
Táto práca spochybňuje paradigmu, že súčasné limity expozície VC (pracovné a environmentálne) sú bezpečné. Aj keď súčasný limit expozície OSHA pre VC je 1 ppm, tento model preukázal, že koncentrácie VC pod touto hranicou sú dostatočné na zlepšenie poškodenia pečene spôsobeného HFD u myší. Tento protokol umožňuje výskumníkom študovať a charakterizovať novú paradigmu toxickej expozície a modelovať TASH.
Toto je prvý model chronickej expozície VC nízkym dávkam. Predchádzajúce práce používali veľmi vysoké bolusové koncentrácie, akútne expozície alebo aktívne metabolity ako náhrady expozície VC. Všetky tieto prístupy znižujú významnosť nálezov pre expozíciu človeka. Preto tento nový model interakcie TASH-NAFLD poskytuje výskumníkom potrebnú platformu na štúdium zložitých interakcií s nízkou expozíciou VC.
Tento model toxického poškodenia pečene je možné použiť pre ďalšie prchavé organické zlúčeniny a tiež na štúdium ďalších interakcií, ktoré môžu mať vplyv na pečeň a ďalšie orgánové systémy 8, 22, 23. Tento model navyše bol a môže byť ďalej použitý na preskúmanie intervenčných terapií a hĺbkových mechanistických štúdií spôsobu účinku tohto prevládajúceho toxického činidla 24. Pretože VC je známym karcinogénom 26, 27, 28, je možné túto paradigmu expozície modifikovať aj pre štúdium rakoviny vyvolanej VC. Spoločná expozícia VC môže tiež zhoršiť ďalšie komorbidity, ako napríklad alkoholické ochorenie pečene. Ďalej by bolo v tomto modeli zaujímavé študovať rôzne druhy tukov, ako sú polynenasýtené mastné kyseliny 18, 29, 30 alebo rôzne druhy sacharidov 31 a ich spoločná expozícia VC. V skutočnosti je známe, že všetky tieto faktory majú rôzny vplyv na vývoj poškodenia pečene a môžu hrať úlohu pri ochoreniach pečene vyvolaných VC.
V súhrne ide o nový inhalačný model environmentálne toxického poškodenia pečene a stanovuje paradigmu expozície pre chronickú nízku expozíciu VC. Koncentrácia VC použitá v tomto modeli je sama o sebe subhepatotoxická, zatiaľ čo u myší zlepšuje poškodenie pečene spôsobené iným faktorom (HFD). Tento model umožní výskumníkom skúmať mechanizmy a intervencie pri chronickej toxicite VC a môže byť užitočný pri translačných štúdiách skúmajúcich vystavené osoby, ktorým je vystavené najvyššie riziko expozície.
Zverejnenie
WT Goldsmith má finančný záujem na IEStechno, šablóne pre opísaný systém. Ostatní autori nemajú čo prezradiť.
Poďakovanie
Táto štúdia bola financovaná z ocenení Národných inštitútov zdravia (K01 DK096042 a R03 DK107912) pre Juliane Beier. Výskum bol podporený aj cenou Institutional Development Award (IDeA) od Národného ústavu všeobecných lekárskych vied pre Národné ústavy zdravia pod číslom grantu P20GM113226 a Národného ústavu pre zneužívanie alkoholu a alkoholizmus Národných ústavov zdravia pod číslom ocenenia P50AA024337. Za obsah zodpovedajú výlučne autori a nemusí nevyhnutne predstavovať oficiálne názory Národných inštitútov zdravia.