Vplyv prenatálneho stresu na myelinizáciu a tvorbu neurónovej siete
Vplyv prenatálneho stresu na myelinizáciu a tvorbu neurónovej siete v mozgu plodu oviec Dizertačnú prácu na získanie akademického titulu doctor medicinae (Dr. med), ktorú Rade lekárskej fakulty Univerzity Friedricha Schillera v Jene predstavila Julia Quendt narodená 5. septembra 1987 v Gothe
Recenzent: 1. Prof. Dr. med. Matthias Schwab/Jena 2. Prof. Dr. med. Richard Berger/Neuwied 3. PD Dr. med. Deň verejnej obrany Bernd Romeike/Jena: 6. mája 2014
Obsah Obsah ZOZNAM SKRATEK I 7 2.2.4.1 Štruktúra a biochemické zloženie myelínového obalu 7 2.2.4.2 Funkcia a význam myelínového obalu 9 2.2.4.3 Vznik a diferenciácia oligodendrocytov 10 2.2.4.4 Časový priebeh myelinizácie 11 2.3 Účinky prenatálneho stresu na vývoj mozgu plodu 13 2.3.1 Cerebrálne účinky stresu matky 13 2.3.2 Cerebrálne účinky prenatálnej liečby glukokortikoidmi 14 2.3.3 Regulácia stresovej osi 16 2.3.4 Účinky materského stresu a prenatálnej terapie glukokortikoidmi na vývoj stresovej osi 18 2.4 Mechanizmy účinkov prenatálneho stresu 19 2.4.1 Prenos materskej Stres na plody 19 2.4.2 Receptorom sprostredkované účinky glukokortikoidov 20 2.4.3 Prenatálny stres a rastové hormóny 21 2.5 Cieľ práce 22
Obsah 3 MATERIÁL A METÓDY 25 3.1 Pokus 25 3.1.1 Experimentálny protokol 25 3.1.2 Získanie mozgov plodu a výroba vzoriek 27 3.2 Histochemické a imunohistochemické farbenie 28 3.2.1 Prehľad farbenia hematoxylínom-eozínom 28 3.2.2 Impregnácia striebrom podľa Bielschowského 29 3.2.3 Imunohistochemická detekcia MBP 31 3.3 Svetelné mikroskopické a PC asistované hodnotenie 35 3.4 Štatistické vyhodnotenie 39 4 VÝSLEDKY 40 4.1 Telesná hmotnosť a hmotnosť mozgu po prenatálnom strese 40 4.2 Mozgové účinky prenatálneho stresu 42 4.2.1 Tvorba neuronálnych procesov v bielej hmote 42 4.2.1.1 Subkortikálna biela hmota 42 4.2.1.2 Corpus callosum 47 4.2.1.3 Sýto biela hmota corona radiata 49 4.2.1.4 Vnútorná kapsula 51 4.2.2 Myelinácia neuronálnych procesov v bielej hmote 53 4.2.2.1 Subkortikálna biela hmota 53 4.2.2.2 Korpus callosum 58 4.2.2.3 Sýto biela hmota - Corona radiata 60 4.2.2.4 Capsula interna 62 4.2.3 Forma Tvorba neurónových štruktúr v hipokampe (oblasť CA3) 64
Obsah 5 DISKUSIA 69 5.1 Diskusia o metódach 69 5.1.1 Zvierací model 69 5.1.2 Stresový model 70 5.1.3 Histológia 72 5.1.4 Kvantitatívna analýza obrazu 74 5.2 Diskusia k výsledkom 75 5.2.1 Prenatálny stres a rast plodu 75 5.2.2 Účinky prenatálneho stresu na hipokampus 78 5.2.3 Cerebrálne účinky po prenatálnom strese na neurónovú sieť 79 5.2.4 Cerebrálne účinky po prenatálnom strese na myelinizáciu 82 6 ZÁVERY 84 7 LITERATÚRA A LITERATÚRA 86 8 DODATOK 102 8.1 Poďakovanie 102 8.2 Čestné vyhlásenie 103
Zoznam skratiek Zoznam skratiek ABC ACTH ADHD AK AP + T AP + T + S Aqua dest. AVP BM CNP (p) CRH GR GT HE HHN osa 11ß-HSD2 IGF MAG MBP MOG MR MW OMgp PBS PLP REM RT SEM SSW Avidín-Biotín-Komplex Adrenokortikotropný hormón Porucha pozornosti/porucha hyperaktivity Pracovný tlmivý roztok Pracovný tlmivý roztok + Triton-X-100 pracovný tlmivý roztok + Triton + sérum Aqua destillata (destilovaná voda) arginín-vazopresín betametazón 2-3-cyklický nukleotid 3-fosfohydroláza (placenta) hormón uvoľňujúci kortikotropín glukokortikoidový receptor gestačný deň (dni) hematoxylín-eozín hypotalamus-hypofýza os Hydroxysteroid dehydrogenáza typu 2 Inzulín podobný rastový faktor S myelínom asociovaný glykoproteín Myelínový bázický proteín Myelín/oligodendrocytový glykoproteín Mineralokortikoidový receptor Priemerná hodnota Oligodendrocytový myelínový proteín Fosfátový tlmivý roztok Proteolipidový proteín Rýchly pohyb očí Štandardná chyba strednej hodnoty
2 Vyvolanie perventrikulárnej leukomalácie (poškodenie bielej hmoty počas predčasného pôrodu) v čase 0,65 gestačného obdobia (čo zodpovedá 24. - 28. týždňu gravidity u ľudského plodu), vysoký stupeň porovnateľnosti vývoja mozgu medzi ovcami plodu a ľuďmi. Podporila to skutočnosť, že v tomto časovom okne začína dozrievanie oligodendrocytov vo fetálnom mozgu oviec a súčasne je možné pozorovať vysoké riziko poškodenia nezrelej periventrikulárnej bielej hmoty u predčasne narodených detí (Back et al. 2006, 2001). . V čase narodenia vykazuje mozog stvorenej osoby o niečo vyšší stupeň zrelosti ako ľudský (McIntosh et al. 1979, Astrom 1967). To by mohlo naznačovať, že tvorivá myseľ v poslednom trimestri dozrieva rýchlejšie. 12
2 Úvod koordinovaná fyziologická odpoveď na rôzne koncentrácie kortizolu (kapitola 2.4.2). Obr.2.3: Os hypotalamus-hypofýza-nadobličky a cesty negatívnej spätnej väzby. Hormón uvoľňujúci kortikotropín (CRH), arginín vazopresín (AVP), proopiomelanokortín (POMC), adrenokortikotropný hormón (ACTH), paraventrikulárne jadro (NPV). Upravené od Metthews 2002. 17
2 Úvod ukazuje podobný časový vývoj mozgu ako človek, aj keď zreje o niečo rýchlejšie. Celkovo bol hodnotený mozog 45 pracovníkov, ktorí boli chronicky stresovaní medzi 0.20-0.66 graviditou (30.-100. GT) a 180minútovou izoláciou dva dni v týždni. Pretože ovce sú stádové zvieratá, izolácia je pre tento druh hlavným stresujúcim faktorom. Aby sa preukázali možné trvalé účinky, mozgy sa hodnotili v čase 0,73 (110. GT, doba gravidity 150 dní) a 0,86 gestácie (130. GT). Výsledky majú pomôcť objasniť účinky prenatálneho stresu na funkciu mozgu v neskoršom veku. 24
3 Materiály a metódy Izolované na dosku iných zvierat, takže na konci protokolu bolo každé zviera 20-krát vystavené individuálnej izolácii. Pretože ovce sú stádové zvieratá, sú na tento stresor obzvlášť citlivé. Meranie hladiny kortizolu pred a počas izolácie dokázalo tento účinok potvrdiť (Rakers et al. 2012). Stresová skupina Kontrolná skupina Synchronizácia cyklu rodu a plánované párenie V POROVNANÍ Vhodný chov vo voľnom výbehu u pastiera Preprava gravidných zvierat do testovacieho laboratória Stres izoláciou 2-krát týždenne po dobu 3 hodín Chronické prístrojové vybavenie Získanie plodových mozgov - skupina 1 Získanie plodových mozgov - skupina 2 Prirodzený termín pôrodu Obr. .3.1: Experimentálny protokol Medzi 100. a 110. GT boli plody inštrumentované pomocou katétrov, ktoré sa používali na kontrolu vnútromaternicových stresových reakcií (uvoľňovanie ACTH a kortizolu). Ich hodnotenie nie je predmetom tejto práce (pozri Rakers 2012). Po ukončení experimentov a operatívnom vývoji plodov sa stanovila ich telesná a mozgová hmotnosť. Tieto merania sa uskutočnili 26. dňa
3 Materiál a metódy stúpajúcej alkoholovej série dehydratovanej a uzatvorenej s montážnym médiom Neo-Mount (MERCK GmbH, Darmstadt, Nemecko). Podrobný protokol zafarbenia je uvedený v tabuľke 3.2. Stredné odparafínovanie: 2x Neoclear 2x izopropanol 100% 1x izopropanol 80% 1x izopropanol 50% destilovaná voda. Impregnácia striebrom: AgNO 3 20% 2x aqua dest. Roztok amoniakálneho dusičnanu strieborného destilovaná voda + nh 3 (4: 1) tiosíran sodný 5% voda z vodovodu destilovaná voda. Dehydratácia: Izopropanol 50% Izopropanol 80% 2x Izopropanol 100% 2x Inklúzia nejadrového balzamu s Entellanom Čas [min]/Teplota [C] 10/RT 5/RT 5/RT 5/RT 3/RT 90/37 30/45 1- 3/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT Tabuľka 3.2: Protokol pre impregnáciu striebrom podľa Bielschowského. Teplota miestnosti. Roztoky sa pripravia nasledujúcim spôsobom: 20% roztok dusičnanu strieborného (AgNO3): 100 ml destilovanej vody. + 20 g dusičnanu strieborného, 5% tiosíranu sodného (Na2S203): 100 ml destilovanej vody. + 5 g tiosíranu sodného Príprava vývojového roztoku: 25 ml destilovanej vody. + 125 mg kyseliny citrónovej (Fluka Chemie, Buchs, Nemecko) + 5 ml 36% formalínu (Carl ROTH GmbH, Karlsruhe, Nemecko) + 8 ul koncentrovanej kyseliny dusičnej-ENT 3 (Fluka Chemie, Buchs, Nemecko). 30
3 Materiál a metódy 2xAP + T ABC komplex: AP + T + roztok A + roztok B AP + T 2x PBS destilovaná voda. 3'3-diaminobenzidín (DAB) 2x aqua dest. Dehydratácia: izopropanol 50% izopropanol 80% 2x izopropanol 100% 2x Neoclear 100% balzam zahrnutý s Entellanom 5/RT 60/37 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT 20 ul každého z roztokov A a B v 1 ml AP + T1Set (H2O2 + DAB) pre 5 ml destilovanej vody, prefiltrujte filtrom Millipore. Tabuľka 3.3: Protokol pre imunohistiochemickú detekciu MBP. Roztoky sa pripravia nasledujúcim spôsobom: Citrátový pufor: 1 liter destilovanej vody. + 2,94 g citrátu sodného (Fluka Chemie, Buchs, Nemecko), pH 6,0. PBS: 1 liter destilovanej vody. + 1 g pracovného tlmivého roztoku D-PBS: 500 ml PBS + 2,5 g hovädzieho sérového albumínu (albumín z hovädzieho séra, minimálne 98%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Nemecko) + 250 ul TWEEN 20 (polyoxyetylénsorbitanmonolaurát) (Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Sternheim, Nemecko) ph 7.5. Roztok DAB (substrát Sigma Fast DAB): 2 tablety (peroxid vodíka močoviny a 3,3-diaminobenzidín) v 5 ml destilovanej vody. krúžte, kým sa hotové tablety úplne nerozpustia. 34
3 Materiál a metódy Obrázok 3.3: HE farbenie prehľadne upravené podľa The Sheep Brain Atlas, Michigan State Unversity Brain Biodiversity Bank, National Science Foundation. https://www.msu.edu/
mozgy/mozgy/ovce/index.html, 15. 2. 2012. Vľavo: Subkortikálna biela hmota vo frontálnej kôre: blízko kôry [1] a ďaleko od kôry [2]; Corpus callosum [3]; Corona radiata [4]; Vnútorná kapsula [5]; SV: bočná komora. Vpravo: oblasť CA3 v hipokampe: ventrálna časť [1], chrbtová časť [2] 36
3 Materiál a metódy Po digitálnom uložení boli záznamy vyhodnotené v programe na spracovanie obrazu (Scion Image 1.62 NIH, USA). Najskôr boli farebné obrázky prevedené na čiernobiele obrázky s 256 odtieňmi šedej. Plocha pozitívneho značenia v reprezentatívnom reze bola stanovená pomocou obrazovej analýzy. Plocha impregnácie imunoštítkom/striebrom odráža imunohistochemickú distribúciu antigénu/hustotu bunkových procesov. V porovnaní s mikroskopickým obrazom bola horná a dolná prahová hodnota nastavená pod vizuálnou kontrolou. Tieto prahové hodnoty tvoria rozsah pre selektívne znázornenie pozitívnej imunoreaktivity MBP alebo strieborných nervových vlákien. (pozri obr. 3.4, červené označenie). Obr.3.4: Analýza obrazu pomocou hodnôt šedej A: Mikroskopický obraz: Neuronálne procesy v subkortikálnej bielej hmote frontálnej kôry vzdialenej od kôry. 37
3 Materiál a metódy B: Značenie zafarbených rozšírení buniek na obrázku v odtieňoch šedej V porovnaní s mikroskopickým obrázkom je na obrázku v odtieňoch šedej definovaná sivá oblasť (na obrázku označená červenou farbou), ktorá zodpovedá pozitívnemu signálu impregnácie striebrom. Táto oblasť sa meria programom na analýzu obrazu. 38