Vplyv sociálnej skúsenosti v ranom detstve na funkčné dozrievanie predného cingulátu
Vplyv sociálnych skúseností v ranom detstve na funkčné dozrievanie prednej cingulárnej kôry krysy kríkovej (Octodon degus) D pre získanie akademického titulu doctor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.), Schválené Fakultou prírodných vied Univerzity Otta von Guerickeho Magdeburg od Dipl.-Biol. Carina Helmeke narodená 3. novembra 1973 v Eberswalde-Finow Recenzentka: Prof. Dr. Katharina Braun PD Dr. Bruno Baumann prof. Dr. Gerd Poeggel Predložené dňa: 14. marca 2003 Obhajoba dňa: 24. júla 2003
Vyhlásenie Týmto prehlasujem, že som dizertačnú prácu, ktorú som zadal, vypracoval na tému: Vplyv sociálnych skúseností v ranom detstve na funkčné dozrievanie prednej cingulárnej kôry krysy krytej (Octodon degus), že som ju zatiaľ ako dizertačnú prácu nepoužil a úplne špecifikoval použité zdroje a pomôcky. . Ďalej vyhlasujem, že som nepredložil túto ani inú prácu iným inštitúciám na dosiahnutie akademického titulu doctor rerum naturalium. Magdeburg, 14. marca 2003 Carina Helmeke
Poďakovanie Rád by som poďakoval všetkým kolegom za neustálu ochotu pomôcť a diskutovať. Špeciálne poďakovanie patrí profesorovi Braunovi a profesorovi Poeggelovi za vedecký dohľad nad touto prácou a za ich cenné rady. Špeciálne poďakovanie patrí tiež mojej rodine za morálnu a finančnú podporu.
VIII. Príloha Vykonanie farbenia Golgi-Coxom Imunohistochémia Meranie ACTH a kortizolu v krvnej plazme Tabuľky 121 123 125 128
Iniciácia je charakterizovaná rozsiahlymi vzájomnými spojeniami s MD talamu (Groenewegen 1988) a sú považované za časti PFC (Uylings & Van Eden, 1990). PrCm ACd M1 PL IL AI Obr. 1. Schematické znázornenie hemisféry (frontálny rez, rostrálny od corpus callosum v pregenualnej rovine): farebné subregióny predstavujú oblasti, ktoré sme v tejto práci skúmali. ACd = predná cingulárna kôra, AI = agranulárna ostrovná kôra, IL = infralimbická kôra, M1 = premotorická kôra, PL = prelimbická kôra, PrCm = precentrálna stredná kôra. (Modifikované od Groenewegen 1988) 5.1. Limbický systém V roku 1939 predstavoval Papez neuroanatomický základ emócií v takzvanom Papezovom kruhu (kruhová blízkosť štruktúr limbického systému) (obr. 2). Pravdepodobne najdôležitejšou štruktúrou pre emočné zložky je amygdala, zatiaľ čo hipokampu, telieskam cicavcov a predným jadrám talamu je zjavne viac zverené ukladanie kognitívnej pamäte. Centrálne jadro amygdaly vyčnieva do orbitofrontálnej kôry a do cingulárneho gyru. Táto cesta je pre vedomých 12
Iniciácia udalostí emocionálneho učenia sa po pôrode. Experimenty s 2-fluór-deoxyglukózou preukázali počas prezentácie materského volania vysokú metabolickú aktivitu v sluchovej kôre, ako aj v mediálnej prefrontálnej kôre a tu najmä v prednej cingulárnej kôre (Poeggel & Braun, 1996). V ACd bola táto aktivácia významne vyššia u chlapcov matiek s normálnym hlasom v porovnaní s matkami, ktoré mlčali (Poeggel & Braun, 1996). Tieto pozorovania naznačujú, že ACd sa podieľa nielen na rozpoznávaní zvuku, ale aj na súvisiacom procese emocionálneho učenia (Poeggel & Braun, 1996; Braun & Scheich, 1997). Už som poukázal na to, že funkčné dozrievanie PFC prebieha pomerne neskoro v postnatálnej ontogenéze. Dá sa preto predpokladať, že tento región je obzvlášť citlivý na emočné vplyvy, a že napr. Odchod rodičov, odlúčenie od rodiny a ďalšie veci, procesy emočného učenia a prežívania v ranom detstve by mali mať osobitný vplyv na funkčné dozrievanie tejto limbickej oblasti mozgu. Obr. 4. Octodon degus, rodičia s mladými vo voliére. Digitálne nahrávanie (SONY Cyber-shot). 15
Úvod Okrem ACd sa hodnotili aj ďalšie podoblasti PFC, a to precentrálna mediálna oblasť (PrCm), prelimbická (PL) a infralimbická (IL) oblasť. 2. Vplyv opakovaného krátkodobého rodičovského ústupu na vývoj neurónov exprimujúcich CRH v mediálnej prefrontálnej kôre (PFC) Ovplyvňuje opakovaná separácia od rodičov a súrodencov vývoj neurónov exprimujúcich CRH v prefrontálnej kôre? Vyjadruje sa CRH inhibičnými interneurónmi v PFC Octodon degus? Kolokalizácia CRH s jedným z proteínov viažucich vápnik sa skúmala pomocou dvojitého fluorescenčného farbenia. 19
Materiál a metódy II Materiál a metódy 1. Chov a držanie pokusných zvierat Pokusnými zvieratami boli mláďatá potkana juhoamerického krysa Octodon degus, ktoré boli chované v kolónii v Leibnizovom inštitúte pre neurobiológiu. Rodiny pozostávajúce z rodičovských zvierat a ich potomkov žili v štandardných klietkach (výška x šírka x hĺbka: 24 x 53 x 32 cm) alebo vo voliérach, ktoré sledovali prirodzené nutkanie zvierat na lezenie (výška x šírka x hĺbka: 70 x 53 x) 43 cm). Ako jedlo bola k dispozícii čerstvá pitná voda, dostatok peliet z potkanov, zelenina a ovocie. Klimatizované miestnosti mali priemernú teplotu 22 C a cyklus svetlo-tma 12/12 hodín. Pokus A - Postnatálny vývoj excitačných systémov a ich vplyv na procesy zážitku v ranom detstve 1.1. Postnatálny vývoj dendritických tŕňov v prednej cingulárnej kôre (ACd) V tejto štúdii boli porovnané štyri experimentálne skupiny sociálne chovaných zvierat, ktoré nerušene vyrastali so svojimi rodinami v štandardných klietkach: P0 (postnatálny deň 0), deň narodenia (n = 4) P14 (na zadnej strane) = 4) P21, (n = 3) P45 (n = 4) 20
Materiály a metódy B Obr. 5. Kryt klietky Octodon degus (A), (B) kryt voliéry. Digitálne nahrávanie (SONY Cyber-shot). 1.3. Vplyv opakovaného krátkodobého rodičovského odňatia na vývoj dendritických tŕňov v prednej cingulárnej kôre (ACd) Na P21 sa porovnávali dve experimentálne skupiny chované vo voliérach: spoločensky chované zvieratá, ktoré zostali v rodine nerušené až do 21. dňa života (n = 4) a 22. dňa
Materiál a metódy Analýza celých dendritických stromov, dátový materiál obsiahnutý v kvantifikáciách je väčší (Bock 1998, dizertačná práca). Pomocou tohto systému analýzy obrazu sa vyhodnotili hustoty dendritických tŕňov na neurónoch vybraných na vyhodnotenie a ich dendritické dĺžky. Pre pyramídovú bunku program Neurolucida počíta priemernú frekvenciu rotácie alebo dĺžku dendritov celého apikálneho a bazálneho dendritu a dĺžku každého rozvetvenia (obr. 7), takže napríklad pre neurón so štyrmi dendritmi 2. rádu možno získať strednú hodnotu frekvencií rotácie dostane štyri segmenty dendritu. Priemerná frekvencia chrbtice alebo dĺžka segmentu pre každý z prvých piatich rádov a celé dendritické stromy neurónu, rozdelené na apikálne a bazálne dendrity, boli zahrnuté do štatistického vyhodnotenia desiatich hodnotených buniek zvieraťa. Výpočet frekvencií odstreďovania a dĺžok dendritov sa uskutočnil až potom, čo boli vyhodnotené všetky zvieratá v testovacej skupine. Obr. 6. Stopy pyramídovej bunky so systémom Neurolucida. Tŕne boli označené bodkami na bazálnom a vrcholovom dendrite. 28
Materiál a metódy 5 4 4 5 3 2 2 3 3 1 Obr. 7. Modelný dendrit s vetvami až do 5. rádu. 2.4. Výber pyramídových buniek Iba dobre a úplne impregnované pyramídové bunky z vrstvy II/III ACd s týmito kvalitatívnymi vlastnosťami (obr. 8): kužeľovitý perikaryon, ktorého pozdĺžna os je takmer kolmá na povrch mozgu, vychádza z apikálneho bodu tela bunky Hlavný dendrit (apikálny dendrit), ktorý má najväčší kaliber zo všetkých dendritov a prebieha kolmo na povrch mozgu, sa v bunkách vybraných pre túto prácu apikálny dendrit delí na dve rovnako silné vetvy, z ktorých potom vznikajú apikálne bočné dendrity, pričom zostávajú bazálne dendrity a axón chvost soma v smere k dreňu, dendritické stromy vrcholových a bazálnych dendritov sú dobre vyvinuté a podľa možnosti úplne zakonzervované. 29
Materiál a metódy A B 5 µm Obr. 8. (A) Golgi-Coxom impregnovaná hemisféra predného mozgu u samca druhu Octodon degus. Čierne sú vyznačené hranice oblasti ACd, z ktorej boli na analýzu vybrané pyramídové bunky. Meracia tyčinka = 400 um, d = dorzálna, m = stredná. (B) Fotomontáž pyramídovej bunky ACd impregnovanej vrstvou Golgi-Coxa II/III ACd s jej apikálnymi a bazálnymi dendritmi (šípky), ako aj so zväčšením dendritového segmentu. Merací prúžok = 18 um. (Od Helmeke et al., 2001b) 2.5. Kvantifikácia a štatistické vyhodnotenie Na kvantifikáciu bolo na zviera vyšetrených päť pyramídových buniek z vrstvy II/III v každej z dvoch hemisfér. Štatistická analýza neodhalila žiadne významné rozdiely medzi hemisférami v žiadnom z experimentov. Preto boli hodnoty z pravej a ľavej hemisféry spojené. Nasledujúce hodnoty desiatich buniek od každého zvieraťa boli teda zahrnuté do štatistického porovnania medzi testovanými skupinami (n = počet buniek na testovanú skupinu): stredná apikálna a bazálna spinálna hustota pre každý z prvých piatich stupňov rozvetvenia, 30
Materiály a metódy znamenajú priemernú dĺžku apikálneho a bazálneho segmentu pre každý z prvých piatich stupňov rozvetvenia, priemernú apikálnu a bazálnu spinovú hustotu všetkých dendritových stromov, priemernú apikálnu a bazálnu dĺžku dendritu všetkých dendritových stromov. Apikálny dendrit a najmenej jeden úplne vysledovateľný bazálny dendrit na bunku sa hodnotili vo všetkých ich vetvách až do posledného stupňa vetvenia. V štatistickom vyhodnotení sa kvôli zriedkavému výskytu vetviacich rádov vyšších ako 5. rád, zobrazilo iba prvých päť rádov (obr. 7) a celý strom dendritov neurónu rozdelený na apikálne a bazálne. Pokiaľ bol počet testovacích skupín v testovacej sérii viac ako dva, boli hodnoty týchto testovacích skupín najskôr skontrolované na významné rozdiely pomocou jednosmernej ANOVA Kruskal-Wallis. Ak tento test ukázal významný rozdiel od p