Aeróbna biogenéza nanočastíc selénu enterobacter cloacae z0206 ako výsledok

predmetov

abstraktné

V tejto štúdii sme skúmali schopnosť Enterobacter cloacae Z0206 redukovať toxický seleničitan sodný a mechanizmus tohto procesu. Zistilo sa, že E. cloacae Z0206 úplne redukuje až 10 mM seleničitanu na elementárny selén (Se °) a za aeróbnych podmienok vytvára nanočastice selénu (SeNP). Efektor znižujúci seleničitan bunky E. cloacae Z0206 by mal byť membránovo lokalizovaný enzým. Analýza proteomu iTRAQ ukázala, že seleničitan indukoval významné zvýšenie expresie fumarátreduktázy. Okrem toho pridanie fumarátu do bujónu a vypnutie fumarátreduktázy (frd) významne znížilo rýchlosť redukcie seleničitanu, čím sa odhalila predtým nerozpoznaná úloha fumarátreduktázy E. cloacae Z0206 pri redukcii seleničitanu. Naproti tomu odpovede sprostredkované malíčkovým glutatiónom neboli primárnou cestou k redukcii seleničitanu. V súhrne možno povedať, že E. cloacae Z0206 efektívne redukoval seleničitan na Se ° pomocou fumarátreduktázy a tvoril SeNPs; Túto schopnosť by bolo možné použiť na vývoj bioreaktora na spracovanie nečistôt Se a na budúcu biosyntézu SeNP.

úvod

Ukázalo sa, že redukcia seleničitanu na Se ° je sprostredkovaná tiolami (malebnými reakciami) v cytoplazme ako súčasť mikrobiálnej detoxikačnej stratégie29. Selenit reaguje s GSH a vytvára selenodiglutatión (GS-Se-SG), ktorý je ďalej redukovaný na NADPH-glutatión reduktázu na glutatión selenopersulfid (GS-Se -). GS-Se - je nestabilný medziprodukt a podlieha hydrolýznej reakcii za vzniku Se ° a redukovaného GSH. Okrem malebných reakcií sa uvádza, že množstvo terminálnych reduktáz pre anaeróbne dýchanie, dve nitritové reduktázy, indukovateľná sulfitreduktáza a fumarátreduktáza sú schopné redukovať seleničitan v bunkách 30, 31, 32. 33 .

Ukázalo sa, že Enterobacter cloacae SLD1a-1, fakultatívny anaerób dýchajúci selenát, katalyzuje redukciu seleničitanu a seleničitanu na Se ° 12, 34, 35 1, 5 mM). Ukázalo sa, že redukcia selenátu je sprostredkovaná membránovo viazaným molybdoenzýmom 36, 37, ale mechanizmus redukcie seleničitanu u tohto kmeňa nebol objasnený. Okrem toho sa všetky testy na redukciu seleničitanu zahŕňajúce E. cloacae uskutočňovali v anaeróbnom prostredí a schopnosť E. Cloacae znižovať seleničitany ešte nebola testovaná za aeróbnych podmienok. Zistilo sa, že E. cloacae Z0206, kmeň, ktorý sme izolovali z „mäsa“ húb Reishi (Ganoderma lucidum) 38, mal vynikajúcu odolnosť voči seleničitanu a toleroval viac ako 100 mM seleničitanu. V tejto štúdii sme skúmali (i) schopnosť E. cloacae Z0206 redukovať seleničitan za aeróbnych podmienok, (ii) vlastnosti a umiestnenie produkovaných SeNP a (iii) mechanizmus redukcie seleničitanu v kmeni Z0206.

Výsledky a diskusia

Rastový profil a schopnosť seleničitanu redukovať E. cloacae Z0206 pri rôznych koncentráciách seleničitanu

biogenéza

Rast a redukcia seleničitanu E. cloacae Z0206 v prítomnosti rôznych koncentrácií seleničitanu. ( A. Zrejmé zmeny spotrebovaného vývaru. ( B. ) Rastový profil pri rôznych koncentráciách seleničitanu. Vzorky 1 ml bakteriálnej kultúry sa zbierali v rôznych časových intervaloch rastu baktérií a potom sa centrifugovali 10 minút pri 4 ° C a 10 000 x g. Proteín bol extrahovaný z pelety pomocou testovacej súpravy na úplnú extrakciu bakteriálneho proteínu. Rast baktérií sa meral kvantifikáciou celkového bunkového proteínu. Stanovila sa koncentrácia proteínu v extraktoch bakteriálnych buniek. ( C. ) Množstvo baktérií v čase 96 hodín. ( D. ) Dynamické zmeny zvyšku seleničitanu v bujóne. ( E. ) Kinetické skúmanie redukcie seleničitanu E. cloacae Z0206 pri rôznych koncentráciách seleničitanu. Čiarové grafy a stĺpcové grafy sú prezentované ako priemer ± SD, ** P

biogenéza

Charakterizácia a lokalizácia SeNP syntetizovaných E. cloacae Z0206. ( A. ) Obrázok SEM E. cloacae Z0206 a SeNPs. ( B. ) EDX analýza obsahu uhlíka, dusíka, kyslíka a selénu v rozmedzí od ( A. ). ( C. ) Elementárna mapovacia analýza distribúcie selénu, uhlíka, kyslíka a dusíka v rozmedzí ( A. ). ( D. ) TEM obrazy E. cloacae Z0206 a SeNPs. ( E. ) EDX analýza častíc 1 a 2 v ( D. ). ( F. ) Vysoké rozlíšenie Se 3D XPS purifikovaných SeNP, syntetizovaných z E. cloacae Z0206.

Schopnosť rôznych bunkových frakcií z buniek E. cloacae Z0206 znižovať selenit

aeróbna

Selenitová redukčná kapacita rôznych frakcií E. cloacae Z0206. Schopnosť baktérie redukovať seleničitan bola stanovená pomocou nasledujúcej reakčnej zmesi: 100 ug proteínu, 10 mM seleničitanu a 10 mM NADH v 200 ul Tris-HCl (pH 7,5). Reakčná zmes sa inkubovala pri teplote 37 ° C počas 8 hodín. Reakčná zmes s celou bunkovou frakciou a bez seleničitanu slúžila ako pozitívna alebo negatívna kontrola.

iTRAQ analýza proteínov Z0206 E. cloacae v reakcii na seleničitan

Spomedzi identifikovaných proteínov selenit indukoval 2,42-násobné zvýšenie frekvencie fumarátreduktázy (tabuľka 1). Li a kol. 33 ukázal, že redukcia seleničitanu v Shewanella oneidensis MR-1 je sprostredkovaná fumarátreduktázou, čo naznačuje, že fumarátreduktáza môže hrať úlohu v procese redukcie seleničitanu v E. cloacae Z0206. Najčastejšie očakávané antioxidačné proteíny, ako je glutatión-syntetáza, glutatión-reduktáza, glutatión-disulfid-reduktáza, tioredoxín, tioredoxín-reduktáza a tioredoxín-závislá tiolperoxidáza, však nevykazovali významnú zmenu v reakcii na liečbu seleničitanom (pozri tabuľku S2, Podporné informácie).

Analýza frekvencie mRNA vybraných génov

Na overenie výsledkov iTRAQ analýzy sa hodnotila frekvencia mRNA enzýmu fumarátreduktázy (frd) a antioxidačných enzýmov glutatiónsyntetázy (gsh A), glutatiónreduktázy (gor), tioredoxínu (trx A) a tioredoxín reduktázy (trx B). Ako je znázornené na obrázku 4, expresia mRNA gsh A, gor, trx A a trx B v bunkách po stimulácii seleničitanom sa nelíšila od expresie pred pôsobením seleničitanu. Liečba seleničitanom však podporovala expresiu mRNA frd spôsobom závislým na čase. Tieto údaje potvrdili, že E. cloacae môže redukovať seleničitan Z0206 na Se 0 fumarátreduktázou namiesto reakcie sprostredkovanej maliarskym GSH.

aeróbna

Vplyv seleničitanu na transkripciu fumarátreduktázy a enzýmov zapojených do malebných reakcií. Kultúra E. cloacae Z0206 cez noc bola upravená na OD600 = 1 a zriedená v čerstvom bujóne (1%). Keď kultúra dosiahla stacionárnu fázu, odobrali sa 2 ml vzorky kultúry (ako kontrola bez obsahu Se). Potom 500 um Bol pridaný 1 podiel zásobného roztoku seleničitanu sodného (1 M) a kultúra bola inkubovaná ďalších 120 minút. Vzorky sa odobrali 30 minút, 60 minút a 120 minút po pridaní seleničitanu. * Str

aeróbna

Vplyv BSO na rast a redukciu seleničitanu E. cloacae Z0206. ( A. ) Rast E. cloacae Z0206 v prítomnosti 1,5 mM, 3,0 mM a 5,0 mM BSO. Bunky sa potom inkubovali v prítomnosti 5 mM seleničitanu s prídavkom 0 mM, 1,5 mM alebo 3,0 mM BSO. V rôznych časoch sa odoberali vzorky na stanovenie zvyškov seleničitanu a bunkové vzorky sa odoberali po 24 hodinách, 48 hodinách a 72 hodinách na meranie intracelulárnych koncentrácií GSH. ( B. ) Zníženie seleničitanu za prítomnosti BSO. Výsledok sa prevedie na percento pôvodnej koncentrácie seleničitanu. ( C. ) Účinok BSO na intracelulárne koncentrácie GSH. * Existovalo P33 a fumarátreduktáza by mohla byť hlavnou cestou redukcie seleničitanu v E. cloacae Z0206.

biogenéza

Metódy

Bakteriálny kmeň Z0206 a kultivačné podmienky

E. cloacae Z0206, kmeň, ktorý sme predtým izolovali 38, bol v optimalizovanom vývare (sacharóza 25, tryptón 5, kvasnicový extrakt 5, K2HPO4.3H202, 62, KH2PO4 1, MgS04 0,5 in) kultivovaného g L1) pri 32 ° C a 250 ot./min.

Rast baktérií pri namáhaní seleničitanom

Účinok seleničitanu na rast E. cloacae Z0206 sa stanovil v prítomnosti 0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM a 15 mM seleničitanu sodného. Bol pripravený seleničitan sodný ako 1 M zásobný roztok a sterilizovaný filtráciou. Potom sa 500 ml Erlenmeyerove banky obsahujúce 100 ml bujónu doplnili zvyšujúcimi sa koncentráciami seleničitanu (0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM a 15 mM) a bakteriálna kultúra cez noc sa znížila na OD600. sada = 0,5 a naočkovaná (1% veľkosť inokula) do vyššie uvedeného bujónu obsahujúceho rôzne koncentrácie seleničitanu, nasledovaná inkubáciou pri 32 ° C, 250 ot./min počas 96 hodín.

Stanovenie koncentrácie seleničitanu

Kultúra sa zhromaždila a centrifugovala pri 10 000 x g počas 10 minút. Supernatant sa zhromaždil na detekciu zvyškového selenitu pomocou 2,3-diaminonaftalénfluórometrickej metódy 41. Ďalšie informácie o detekcii seleničitanu nájdete v časti 1.2 v časti „Ďalšie informácie“.

SEM a EDX analýza

Kultúry Z0206 v prítomnosti rôznych koncentrácií seleničitanu (0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM a 15 mM) boli zhromaždené. Tieto vzorky sa centrifugovali pri 4 ° C a 12 000 x g po dobu 15 minút a potom sa pelety premyli (0,1 M PBS), zafixovali sa, vysušili a naprašovali, nasledovalo pozorovanie pod SEM. Mapy zloženia prvkov vybraných oblastí boli analyzované pomocou systému EDX.

Analýza TEM a EDX

Kultúry Z0206 pestované v prítomnosti rôznych koncentrácií seleničitanu (0 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM a 15 mM) boli zhromaždené. Tieto vzorky sa centrifugovali 15 minút pri 4 ° C a 12 000 x g a potom sa pelety premyli (0,1 M PBS), zafixovali, vysušili a zaliali. Ultratenké rezy 100 nm boli narezané a zafarbené, nasledované pozorovaním pod TEM. Elementárne zloženie vybraných častíc sa analyzovalo pomocou systému EDX.

Pozri analýzu mocenstva častíc

E. cloacae Z0206 sa kultivoval v prítomnosti 5 mM seleničitanu po dobu 72 hodín pri 32 ° C a 250 ot./min. Častice selénu sa získali z kultúry spôsobom opísaným v Dobias a kol. Samostatne vyvinutý protokol. 42. s malou zmenou. Stručne, kultúra sa dekantovala, nasledovala jednoduchá centrifugácia pri 4 ° C pri 8 000 x g po dobu 10 minút, aby sa oddelila suspendovaná biomasa. Zhromaždené častice Se prítomné v supernatante z predchádzajúceho kroku centrifugácie sa koncentrovali centrifugáciou pri 4 ° C a 20 000 x g počas 15 minút. Peleta sa potom lyofilizovala a analyzovala pomocou XPS.

Separácia bunkových frakcií a stanovenie aktivity znižujúcej seleničitan

Kultúra E. cloacae Z0206 pestovaná do exponenciálnej fázy bez seleničitanu sa zhromaždila a centrifugovala 10 minút pri 4 ° C a 10 000 x g. Supernatant sa potom zhromaždil a prefiltroval pomocou 0,2 um filtra. Ďalej bola peleta dvakrát premytá 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) a resuspendovaná v rovnakom pufri na sonifikáciu, po čom nasledovala centrifugácia pri 4 ° C pri 6 000 x g po dobu 10 minút, aby sa oddelili nerozbité bunky. Potom bol supernatant centrifugovaný pri 4 ° C pri 25 000 x g počas 40 minút, aby sa oddelili cytoplazmatické (supernatant) a membránové (pelety) frakcie. Koncentrácia proteínu sa merala pomocou BCA testovacej súpravy.

RT-PCR analýza

RNA bola extrahovaná pomocou súpravy RNeasy Protect Bacteria Mini Kit. Celková RNA sa podrobila reakcii reverznej transkripcie pomocou súpravy reverznej transkripcie Quanti Tect. Kvantitatívna PCR sa uskutočňovala pomocou systému PCR v reálnom čase StepOne Plus ™ s použitím FastStart Universal SYBR Green Master (ROX).

Stanovenie intracelulárnych koncentrácií GSH

Bunky odobraté z experimentu na tému "Vplyv BSO na redukciu seleničitanu v E. cloacae Z0206" v časových bodoch 24 h, 48 h a 72 h sa koncentrovali centrifugáciou pri 10 000 x g, 4 ° C počas 10 minút a resuspendované v 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), potom boli bunky rozbité pomocou ultrazvuku. Narušené bunky sa centrifugovali pri 20 000 x g počas 15 minút a supernatanty sa zhromaždili na stanovenie koncentrácie GSH pomocou súpravy Total Glutathione Assay Kit.

Konštrukcia Δ frd mutanta

& Dgr; prvý mutant bol skonštruovaný tak, ako je uvedené inde 43. Stručne, fúzny fragment frd génu bol amplifikovaný a ligovaný pomocou PCR, potom ligovaný s pLP12 a následne transformovaný do Escherichia coli β2163. Výsledné plazmidy sa vložili do E. cloacae Z0206 konjugáciou s E. coli p2163. Po dvoch kolách selekcie bol mutant, ktorý niesol deletovaný gén frd, validovaný pomocou PCR s použitím primerov, ktoré zodpovedali sekvenciám pred a po delécii (pozri S4 v doplňujúcich informáciách), a potom sekvencovaný.

štatistika

Na stanovenie štatistickej významnosti pre viacnásobné porovnania sa použila jednosmerná analýza variancie (ANOVA), po ktorej nasledoval viacnásobný porovnávací test LSD, a na párové porovnania sa použil Studentov t-test. P