Analýza génovej expresie - biológia

biológia

The Analýza génovej expresie sa týka vyšetrovania implementácie genetickej informácie (génovej expresie) pomocou molekulárno-biologických a biochemických metód. Môže sa použiť ako pre jednotlivé prepisy, tak pre celý prepis a umožňuje kvalitatívne a kvantitatívne vyjadrenia o aktivite génov. Zatiaľ čo v prvom prípade je potrebné poznať iba sekvenčnú informáciu transkriptu, ktorá sa má preskúmať, na analýzu transkriptomu je potrebná celá sekvenčná informácia transkriptomu.

V molekulárnej biológii možno aktivitu a expresiu tisícov génov merať súčasne pomocou analýzy génovej expresie, ktorá umožňuje prehľad o bunkových funkciách. Profily génovej expresie sa môžu použiť napríklad na identifikáciu buniek, ktoré sú v aktívnej fáze delenia, alebo na preukázanie odpovede buniek na špecifické ošetrenie. Mnoho takýchto experimentov skúma celý genóm, teda každý gén konkrétnej bunky.

Technika DNA microarray [1] meria relatívnu aktivitu predtým identifikovaných cieľových génov. Na analýzu génovej expresie sa používajú aj sekvenčne založené metódy, ako je sériová analýza génovej expresie (SAGE, SuperSAGE). SuperSAGE je obzvlášť presný, pretože táto metóda sa neobmedzuje iba na preddefinované gény, ale môže merať akýkoľvek aktívny gén. So zavedením metód sekvenovania novej generácie sa sekvenčná analýza expresie tešila čoraz väčšej popularite ako digitálna alternatíva k mikročipom. Napriek tomu sa mikročipy používali častejšie, čo dokazuje použitie tejto metódy v 17 000 článkoch PubMed do roku 2006.

  • Je za daných okolností vôbec exprimovaný gén?
  • V ktorých bunkách dochádza k expresii (napr. Hybridizácia in situ)?

  • Aký veľký je rozdiel vo vyjadrení v porovnaní s definovaným odkazom?
    • zdravé vs. choré bunky
    • Bunky divokého typu vs. mutantné bunky
    • nestimulované vs. stimulované bunky

V závislosti od metódy sa analyzujú produkty rôznych úrovní génovej expresie:

Metódy

  • Pri hybridizácii in situ sa v tkanive deteguje sekvenčne špecifická RNA definovaného súboru génov/génov a stanoví sa vzor lokálnej génovej expresie.
  • Pri metóde Northern blot sa najskôr izoluje RNA a elektroforeticky sa separuje podľa jej veľkosti v géli. Po jej prenesení na membránu (blotovanie) sa požadovaná sekvencia RNA deteguje značenými sondami (rádioizotopy, fluorescenčné farbivá) vyrobenými z komplementárnej RNA alebo DNA prostredníctvom komplementárnej väzby. Spravidla sa skúma iba malý počet sekvencií súčasne.
  • V DNA mikročipoch alebo makročipoch možno určiť množstvo mRNA veľkého počtu génov z buniek kultúry/tkaniva súčasne. Za týmto účelom je mRNA izolovaná a transkribovaná do cDNA. Pomocou tejto metódy detekcia prebieha prostredníctvom komplementárnej hybridizácie značenej cDNA (rádioizotopy, fluorescenčné farbivá) so sondami DNA poľa.
  • Sériovou analýzou génovej expresie (SAGE) a najmä SuperSAGE možno expresiu teoreticky všetkých génov bunky určiť veľmi presne tak, že sa z každého prepisu vygeneruje krátka sekvencia (takzvaná „značka“ = značka) a čo najviac z týchto značiek sú zoradené. Výhodou oproti mikročipom je oveľa presnejšia kvantifikácia transkriptov, ako aj možnosť (najmä pri SuperSAGE) identifikovať nové transkripty (napr. Nekódujúce ribonukleové kyseliny, ako sú mikroRNA alebo antisense RNA) a skúmať organizmy s predtým neznámymi genómami.
  • Kvantitatívna PCR v reálnom čase je variantom polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Farbivá alebo špeciálne sondy pridané do reakčnej zmesi monitorujú koncentráciu produktu počas PCR. Zmena koncentrácie v priebehu času umožňuje vyvodiť závery o počiatočnej koncentrácii príslušnej nukleovej kyseliny.
  • Pri použití metódy Western blot sa proteíny separujú s ohľadom na rôzne vlastnosti, ako je veľkosť, elektrický náboj alebo izoelektrický bod, a potom sa detegujú pomocou protilátok. Spravidla sa skúma iba zvládnuteľný počet génových produktov súčasne.
  • Diferenciálna analýza 2D gélov umožňuje expresiu až 10 000 proteínov súčasne. Za týmto účelom sa proteínové extrakty získajú z bunkových kultúr/tkanív, rozdelia sa dvojrozmerne podľa izoelektrického bodu a molekulovej hmotnosti a detegujú sa a kvantifikujú sa značením alebo rôznymi (fluorescenčnými) farbiacimi technikami. Stanovené intenzity rôznych vzoriek sa navzájom porovnávajú, a tak sa sleduje správanie expresie za rôznych podmienok.
  • V proteínových poliach sa analogicky k DNA poliam skúma množstvo určitých proteínov. Na detekciu sa používajú početné interakcie medzi proteínmi a inými molekulami: B. Interakcia enzým-substrát, protilátka-antigén alebo receptor-posol.
  • V posledných rokoch je čoraz dôležitejšia hmotnostná spektrometrická analýza proteínových zmesí. Pomocou "spektrálneho množstva" sa počítajú proteínové kúsky peptidov, podobne ako fragmenty DNA existujúcich RNA v SAGE, a tak sa kvantifikuje ich frekvencia. Iné metódy používajú ako mieru frekvencie intenzitu signálu určitých peptidov v hmotnostnom spektre.

Mnoho metód používa fluorescenčné farbivá, ktoré sú spojené so sondami (RNA sondy, protilátky, atď.) A sú viditeľné pomocou fluorescenčnej spektroskopie alebo fluorescenčnej mikroskopie. Druhá možnosť ponúka výhodu vysokého priestorového rozlíšenia. Ďalej sa používajú rádioaktívne značené sondy alebo sondy, ktoré prevádzajú chromogény na farbivá pomocou viazaných enzýmov.

Porovnanie s proteomikou

Ľudský genóm obsahuje asi 25 000 génov, ktoré spoločne vytvárajú asi 1 000 000 rôznych proteínov. Táto rozmanitosť vzniká hlavne post-translačnými modifikáciami, takže jediný gén môže slúžiť ako templát pre mnoho rôznych verzií proteínu. V jednom experimente s hmotnostnou spektrometriou možno identifikovať asi 2 000 proteínov [5] (0,2% z celkového množstva). Vedieť o jednotlivých proteínoch, ktoré bunka produkuje (proteomika), je dôležitejšie ako vedieť, koľko mRNA produkuje každý gén. Analýza génovej expresie však poskytuje najlepší možný prehľad, aký je možné získať v jednom experimente.

Používa sa na vývoj a testovanie hypotéz

obmedzenia

Validácia vysokovýkonných metód

Ako mikročipy DNA, tak qPCR používajú preferovanú väzbu komplementárnych sekvencií nukleových kyselín („párovanie báz“) a obidve metódy sa používajú, často za sebou, na vytvorenie profilov génovej expresie. Aj keď majú mikročipy DNA vysokú priepustnosť, chýba im vysoká kvantitatívna presnosť qPCR. Avšak súčasne s určením expresie niekoľkých desiatok génov pomocou qPCR je možné pomocou DNA mikročipov preskúmať celý genóm. Z tohto dôvodu má často zmysel najskôr vykonať semikvantitatívnu analýzu DNA microarray s cieľom identifikovať kandidátske gény, ktoré je potom možné overiť a presnejšie kvantifikovať pomocou qPCR. Ďalšie experimenty, ako napríklad Western blotovanie proteínov rôzne exprimovaných génov, môžu pomôcť podporiť výsledky analýzy génovej expresie, pretože koncentrácie mRNA nevyhnutne nekorelujú s množstvom exprimovaného proteínu.

Štatistická analýza

Génová anotácia

Pomocou štatistických metód je možné spoľahlivo identifikovať gény, ktorých produkty sa za experimentálnych podmienok menia. Pre zmysluplnú interpretáciu profilov expresie je nevyhnutné vedieť, ktorý proteín je kódovaný ktorým génom a akú funkciu má. Tento proces sa nazýva anotácia génov. Niektoré anotácie sú spoľahlivejšie ako iné a niekedy úplne chýbajú. Databázy anotácií génov sa neustále menia a rôzne databázy používajú rôzne názvy toho istého proteínu, čo odráža zmenu chápania jeho funkcie. Použitím štandardizovanej nomenklatúry génov sa predchádza problémom s rôznym pomenovaním, presné priradenie transkriptov génom [13] [14] však zostáva dôležitou výzvou.

Klasifikácia regulovaných génov

Ďalším krokom po identifikácii skupiny diferenciálne regulovaných génov je hľadanie vzorcov v rámci tejto skupiny. Majú proteíny, pre ktoré tieto gény kódujú, podobné funkcie? Sú si chemicky podobné? Sú umiestnené v podobných bunkových oddieloch? Analýza génovej ontológie poskytuje bežný spôsob definovania týchto vzťahov. Génová ontológia začína veľmi širokou hornou kategóriou, napríklad „metabolickým procesom“, a potom ich rozdeľuje na menšie podkategórie, ako napríklad „metabolizmus uhľohydrátov“, ktoré sa dajú rozdeliť do konkrétnejších podskupín, ako je „fosforylácia inozitolu a derivátov“. Gény majú okrem svojej biologickej funkcie, chemických vlastností a bunkovej polohy aj ďalšie vlastnosti. Gény možno napríklad klasifikovať do skupín na základe ich vzťahu k iným génom, ich spojitosti s chorobami alebo ich interakcie s liekmi alebo toxínmi. Databáza molekulárnych podpisov [15] a komparatívna toxikogenomická databáza [16] umožňujú kategorizáciu génov rôznymi spôsobmi.

Rozpoznávanie vzorov medzi regulovanými génmi

Keď sa regulované gény roztriedia podľa toho, čo sú a čo robia, môžu vzniknúť dôležité vzťahy medzi rôznymi génmi [18]. Môžete napríklad získať znamenie, že konkrétny gén kóduje proteín, ktorý vytvára enzým, ktorý následne aktivuje proteín, ktorý reguluje druhý gén na našom zozname. Tento druhý gén by mohol byť transkripčný faktor, ktorý zase reguluje ďalší z našich kandidátskych génov. Pozorovaním týchto vzájomných prepojení môžeme predpokladať, že ide iba o náhodné asociácie a že všetky tieto gény sú na našom zozname, pretože sú súčasťou biologického procesu. Na druhej strane, gény, ktoré sú navzájom nezávislé a sú úplne náhodne vybrané, môžu samozrejme vytvárať dojem, že sú súčasťou spoločného procesu, aj keď to tak nie je.

Vzťahy príčin a následkov

Používanie vzorov na rozpoznávanie regulovaných génov

Závery

Analýza génovej expresie poskytuje nové informácie o tom, ako sa správajú gény za rôznych podmienok. Techniky microarray celkovo vytvárajú spoľahlivé profily expresie [24]. Na základe týchto údajov je možné zostaviť nové biologické hypotézy alebo skontrolovať existujúce hypotézy. Rozsah a zložitosť týchto experimentov však často vedie k rôznym interpretáciám. V mnohých prípadoch vyžaduje analýza dát profilov expresie na generovanie údajov podstatne viac času a úsilia ako pôvodný experiment. Mnoho vedcov používa niekoľko štatistických metód a predbežnú analýzu údajov a pred zverejnením výsledkov analýz génovej expresie sa poradí s biostatistikmi alebo inými odborníkmi v oblasti technológie microarray. Dobré experimentálne usporiadanie, dostatočný počet biologických replikátov a opakované experimenty zohrávajú kľúčovú úlohu pri uskutočňovaní úspešných analýz génovej expresie.