ASPEKTY TÝKAJÚCE SA PARAZITU SLNEČNÉHO KVETU OROBANCHE CUMANA WALLR
ÚSTAV GENETIKY, FYZIOLÓGIE A OCHRANY RASTLÍN Ako rukopis MDT: [630.165.7 + 575,16 + 632,53]: 633,854,78 ASPEKTY GOOSE ION TÝKAJÚCE SA PARASITU KVETU SLNEČNEJ OROBANČE C. S OSOBITNÝM ODKAZOM NA GENETICKÚ ODOLNOSŤ 411.04. ZLEPŠENIE RASTLINY A VÝROBA SEMENA Doktorandská práca z poľnohospodárskych vied Vedeckí vedúci DUCA Maria, doktorka habilitátov z biologických vied, univerzitná profesorka, akademička, 162.01 Genetika rastlín, 164.02 Fyziológia rastlín JOIŢA-PĂCUREANU Maria, doktorka vo výskume, poľnohospodárska veda, rastlín Autor GÎSCĂ Ion CHIŞINĂU, 2018
ZOZNAM SKRATIEK ASC cytoplazmatická androsterilita dntp - deoxynukleotidy (deoxynukleotidy) Organizácia OSN pre výživu a poľnohospodárstvo FAO Národný inštitút pre poľnohospodársky výskum a vývoj INCDA GS skupina glutamín syntetázy GOGAT Odkaz väzba) MMB Hmotnosť 1 000 zŕn bp párov báz PCR - polymerázová reťazová reakcia PIC Polymorfný informačný obsah RAPD - náhodná amplifikovaná polymorfná DNA RFLP - obmedzenie Fr Polymorfizmus Rf - obnovovač plodnosti SCF sekvencia charakterizované zosilnené oblasti SSR jednoduchá sekvencia opakovanie sekvencie STS označené stránky (sekvencia opakovania stránok) S Značené sekvencie) TAE Tris-acetát-EDTA TRAP Zosilnenie cieľovej oblasti Polymorfizmus QTL Kvantitatívne znaky lokusu (kvantitatívne zameranie znaku) 7
nasledujúci program: 3 minúty pri denaturácii pri 95 0 C, po ktorých nasleduje 35 cyklov s nasledujúcim teplotným profilom: 45 sekúnd pri denaturácii pri 95 0 C; 1 minúta pri 34 - 36 ° C - fixácia primérov; 1 minúta pri predĺžení 72 ° C a 5 minút pri konečnom predĺžení 72 ° C. 2.3. Metódy štatistického výpočtu Štatistické spracovanie údajov sa uskutočnilo po Dospehov B. [36] a Ceapoiu N. [7] pomocou počítačového programu Microsoft Excel. Pre výsledky získané z výskumov boli určené: hodnota aritmetického priemeru, odchýlka (S2), štandardná odchýlka (odchýlky), variačný koeficient (S%). 2.4. Závery v kapitole 2 Pre štúdie bol vybraný a opísaný obrovský biologický materiál, ktorý predstavuje cenné genetické zdroje používané pri šľachtení, ako aj perspektívne hybridy. Použité metódy výskumu a kultivačné podmienky zodpovedajú oblasti skúmania a sú široko používané pri zlepšovaní kultúry v Moldavskej republike aj v Rumunsku. Metodika výskumu zahŕňala spolu s tradičnými metódami štúdia aj techniky molekulárnej analýzy zodpovedajúce súčasným trendom výskumu. 38
Braila 9,40% 8,10% 6,10% 2,30% 39,00% ABCDE 11,50% F 23,60% G Constanta 10% 7,50% 4,10% 36% ABCD 10,60% EF 11,50% 20,30% G Tulcea 7,80% 9,40% 7,70% 35,10% ABCD 9,70% EF 10,50 19,80% G; H Obr. 3.6. Miera výskytu vlčích plemien (O. cumana) v troch rôznych oblastiach v roku 2012. Nové, veľmi virulentné populácie vlčieho parazita sa v súčasnosti vyskytujú v slnečnicovej kultúre v Rumunsku, Moldavskej republike, Rusku, Španielsku a Turecku. tvrdí, že pre práce na zdokonalení sú dôležité stále štúdie o vývoji parazita a identifikácia nových zdrojov rezistencie, ktoré sa zavedú do experimentálnych genotypov a cenných, konkurenčných komerčných hybridov odporúčaných na kultiváciu vo veľkom priestore. 51
Analýza dendrogramu (obrázok 3.13) zdôrazňuje dve spojovacie skupiny A a B, ktoré sú naopak rozdelené do dvoch podskupín A1, A2 a B1, B2. Obr. 3.13. Dendrogram genotypov H. annuus L. na základe profilov RAPD (OPA-11). Podskupina A1 je rozdelená do dvoch ďalších podskupín A1.1, ktoré zahŕňajú päť rodičovských foriem (MS-2440C, MS-2275C, MS-3470C charakterizované ako stredne odolné voči rezistentným formám a MS-2555C, MS-2540C charakterizované ako environmentálne citlivé formy. na citlivé). Analýza genetického polymorfizmu s arbitrárnym primérom OPA-02 Výskum zameraný na amplifikáciu genómovej DNA 42 genotypov slnečnice s arbitrárnym primérom OPA-02 zdôraznil generáciu 14 amplifikačných produktov, ktoré boli polymorfné pre všetky analyzované genotypy ( Obrázok 3.14.). Analyzované amplikóny boli charakterizované dĺžkami 250 2500 bp. Otcovské slnečnicové genotypy MS-1985C a MS-2550C boli zvýraznené vzhľadom pásma 250 bp, ktoré bolo charakteristické pre všetky materské formy okrem MS-2098A a MS-2036A, pričom tento amplikón pri 65 bp úplne absentoval.
Obr. 3.15. Dendrogram genotypov H. annuus L. na základe profilov RAPD (OPA-02). Podskupina B1 je veľmi rozmanitá a spája rodičovské aj materské formy a všetky hybridy zahrnuté do štúdie okrem hybridu Doina vedľa skupiny A. Podskupina B2 obsahuje dve otcovské formy MS-2540C, zarovnané v podskupine B2.1.1 a jediný genotyp zarovnané do podskupiny B2.2, ktorá je stredne citlivou a citlivou otcovskou formou - MS-2005C. Zvyšok v tejto podskupine sú štyri rezistentné materské formy (MS-2077A, MS-2067A, MS-2039A a MS-2075A), stredne rezistentná na rezistentnú formu (MS-2091A) a stredne rezistentný na rezistentný hybrid Caesar. Genotypy slnečnice z otcovej strany MS-2540C, MS-2400C a hybridy Codru a Dacia sa odlišovali maximálnym počtom amplifikačných produktov (14). Elektroforetické spektrum pôvodnej formy MS-2440C sa stanovilo prítomnosťou minimálneho počtu generovaných amplikónov (8). 67
Vyšetrovania uskutočňované v poliach Constanţa (obrázok 3.22.) Preukázali citlivosť hybridov na plemená prítomné v tejto oblasti, takže žiadny hybrid vrátane svedkov odporu nie je úplne odolný. Stupeň napadnutia je aj v tomto prípade nižší v porovnaní s rokom 2012. 70 60 Napadnutie vlkom (%) 50 40 30 20 10 0 HS-3434 HS-3912 HS-4206 OBĽÚBENÝ SANDRÍNOVÝ KÓD BITCH NEPTUNE Hybridy Obr. 3.22. Stupeň napadnutia vlčieho parazita v roku 2013 na súpravu hybridov, 12 hybridov slnečnice, v oblasti Konstanca. FLORISUN LG5631 PR64 A71 Citlivá kontrola S cieľom vyhodnotiť správanie niektorých experimentálnych hybridov voči parazitom, u ktorých sa pomerne rýchlo vyvinú nové formy. so zvýšenou virulenciou sa v rokoch 2012 a 2013 vykonali testy na množstve 25 slnečnicových genotypov v oblastiach Brăila a Tulcea (tabuľka 3.16, 3.17). Väčšina analyzovaných hybridov bola významne infikovaná vlkmi v obidvoch oblastiach s vyšším stupňom napadnutia, čo je potrebné zohľadniť varianty vypestované v poliach Tulcea (obrázok 3.23, 3.24.). Obr. 3.23. Rastliny slnečnice ovplyvnené vlkmi (oblasť Brăila). 72
Obr. 3.24. Rastliny slnečnice ovplyvnené vlkmi (oblasť Tulcea). (Tab. 3.16). V oblasti Brăila bol v roku 2012 vyšší stupeň napadnutia v porovnaní s rokom 2013 č. variant Tabuľka 3.16. Výsledky týkajúce sa útoku vlkov (O. cumana Wallr.) Na niektorých genotypoch slnečnice, Brăila Nr. slnečnice spolu/parcela č. vlčie rastliny/rastlina slnečnica stupeň napadnutia (%) 2012 2013 2012 2013 2012 2013 1 33 30 0 0 0 0 2 31 30 0 0 0 0 3 31 29 0 0 0 0 4 29 28 17-20 5- 6 31,4 10,7 5 30 31 0 0 0 0 6 32 34 0 0 0 0 7 30 34 0 0 0 0 8 34 33 11-14 3-4 27,7 17,4 9 30 33 8-9 2 -3 24,9 11,7 10 28 34 1-2 0-1 5,8 3,2 11 30 31 0 0 0 0 12 32 32 3-4 0-1 3,7 0,9 13 33 34 7-8 1 -2 11,7 1,8 14 30 33 1-2 0-1 1,9 0,2 15 30 31 8-9 2-3 19,6 8,5 16 29 31 6-7 2-3 22,8 10, 8 17 32 33 0 0 0 0 18 30 31 17-18 11-12 38,4 25,7 19 33 30 19-20 10-12 51,4 33,4 20 28 30 2-3 0-1 4,9 0,8 21 27 30 14-15 9-10 38,9 28,5 22 34 32 1-2 0-1 3,2 1,4 23 31 33 4-5 1-2 7,3 3,5 24 30 34 0 0 0 0 25 32 33 1-2 0-1 4,1 1,7 svedok 33 34 23-24 12-14 100 100 73
Obr. 4.3. Vplyv stupňa zamorenia O. cumana Wallr. (podmienky prirodzenej infekcie) na páse rastliny slnečnice, rok 2012. 4.4. Vplyv stupňa zamorenia O. cumana Wallr. (prirodzené infekčné podmienky) v páse slnečnicovej rastliny, 2013. Najčastejšie boli ovplyvnené hybridy HS 5436, HS 5540, Doina a Performer, ktoré vykazovali hodnoty medzi 140-145 cm v porovnaní so 168-178 cm zaznamenané v kultivovaných variantoch na poliach bez infekcie, naznačuje pokles o 15 - 21%. Maximálny pokles veľkosti rastlín (21%) sa zistil u hybridu Performer, ktorý je citlivý na pôsobenie vlčieho parazita a vykazoval najvyšší stupeň infekcie (70,8% v roku 2012 a 69,4% v roku 2013). V prípade hybridov HS 5651, HS 4380, HS 4879, Zimbru, Milenium, PR64A83 a HS 5936 sa nepozorovali žiadne korelácie medzi stupňom napadnutia a veľkosťou rastliny. Aj keď bol teda zaznamenaný pomerne vysoký stupeň napadnutia (33,7 - 60,4%), analyzovaný parameter bol ovplyvnený v malom rozsahu (až 10%) alebo vôbec. Nedostatok korelácií medzi veľkosťou rastliny a stupňom napadnutia vlkmi zistili Louarn J. a spoluautori pri analýze slnečnicovej línie [120]. 80
4.2. Hektolitrová hmota a hmotnosť 1 000 zŕn Bol študovaný vplyv útoku parazita vlka v podmienkach prirodzeného napadnutia na hektolitrovú hmotu a hmotnosť 1 000 zŕn počas dvoch rokov (2012 a 2013). Hodnoty týkajúce sa parametra hmotnosti hektolitra sa pohybovali v medziach 32,0 - 43,7 kg v prípade neprítomnosti infekcie a 25,3 - 40,7 kg v prípade jeho prítomnosti, maximálnu produktivitu predstavuje hybridný HS 5936 (obrázok 4.5). Obr. 4.5. Vplyv stupňa zamorenia O. cumana Wallr. (podmienky prirodzenej infekcie) na hektolitrovú hmotu slnečnicových semien, rok 2012. Hektolitrová hmotnosť klesla v priemere o 14% v roku 2012 a o 10% v roku 2013 (obrázok 4.6). V roku 2013 sa analyzovaný index pohyboval medzi 35,0 - 43,7 kg v prípade neprítomnosti infekcie a 30,0 - 40,7 kg v prípade jeho prítomnosti, čo ukazuje väčšie poklesy o 11,5 a 16,6% v prípade hybridov. HS 5436 a účinkujúci. Obr. 4.6. Vplyv stupňa zamorenia O. cumana Wallr. (prirodzené infekčné podmienky) na hektolitrovú hmotu slnečnicových semien, 2013. 81
Obr. 4.9. Vplyv stupňa zamorenia O. cumana Wallr. (podmienky prirodzenej infekcie) na priemere slnečnice calatidium, rok 2012. Na základe analýzy údajov za dva roky štúdií boli zjavné korelácie medzi stupňom napadnutia a veľkosťou kalatídia. Teda najmenšie hodnoty priemeru kalatídia, medzi 13,4-17,4 cm v podmienkach infekcie, v porovnaní s 21,1-23,8 cm v neprítomnosti infekcie, boli zaznamenané u hybridov HS5436, HS5540, HS4380, HS4879, Doina a Performer, sa vyznačuje vyššou úrovňou zamorenia. Na druhej strane v prípade hybridov Codru, LG5661 a PR64A71, ktoré sa vyznačujú najnižším stupňom napadnutia, majú kalatídie prakticky rovnaké rozmery ako vzorky kultivované bez prítomnosti infekcie. Obr. 4.10. Vplyv stupňa zamorenia O. cumana Wallr. (podmienky prirodzenej infekcie) na priemere slnečnice calatidium, 2013. Výraznejšie zníženie (15,6-23,0%) rýchlosti tuhých semien na kalatídium v podmienkach napadnutia vlkom bolo fixované v hybridoch, HS-4380, HS 5540, HS-4879, Zimbru, Doina a Performer (obrázok 4.11 a 4.12). 84
Obr. 4.11. Vplyv stupňa zamorenia O. cumana Wallr. (podmienky prirodzenej infekcie) na miere plného osiva na kaladídium, rok 2012. Zistilo sa, že hybridy Doina a Performer s najvyšším stupňom napadnutia parazitom boli najviac ovplyvnené vlkmi, čo vykazovalo významne znížené indexy u všetkých študovaných charakteristík. Obr. 4.12. Vplyv stupňa zamorenia O. cumana Wallr. (podmienky prirodzenej infekcie) na miere plného osiva na kalatídium, rok 2013. Pri zovšeobecňovaní získaných výsledkov sa potvrdzuje, že analyzované parametre sú ovplyvnené vlčím útokom, v prípade priemeru kalatídia sú zjavnejšie korelácie medzi stupňom napadnutia a hodnotou indexov produktivity., ktorý významne poklesol u všetkých genotypov charakterizovaných veľkým zamorením. Vyššiu asociáciu stupňa napadnutia s priemerom kalatídia a hmotnosťou 1 000 semien v porovnaní s indexom výšky rastlín zaznamenali aj Shindrova P. a spoluautori [160]. Stanovené korelácie potvrdzujú údaje z roku 2013 (obrázok 4.12), až na to, že v dôsledku menej závažného útoku boli straty v tomto roku 85
Príloha 1. Hybridy slnečnice testované a registrované v Katalógu odrôd rastlín Moldavskej republiky Obr. 1. Osvedčenie o odrode rastlín (odroda Codru) 117
Obr. 2. Osvedčenie o odrode rastlín (odroda Dacia) 118
Obr. 3. Osvedčenie o odrode rastlín (odroda Doina) 119
Obr. 4. Osvedčenie o odrode rastlín (odroda Nistru) 120
Obr. 5. Osvedčenie o odrode rastlín (odroda Talmaz) 121
Obr. 6. Osvedčenie o odrode rastlín (odroda Zimbru) 122
Obr. 7. Osvedčenie o odrode rastlín (odroda Caesar) 123
Príloha 2. Zákon, ktorým sa vykonávajú vedecké výsledky zlepšovania 124
VYHLÁSENIE TÝKAJÚCE SA NÁVRHU AUTORSKÝCH PRÁV Podpísaný (á) prehlasuje (a) na vlastnú zodpovednosť, že materiály uvedené v dizertačnej práci sú výsledkom ich vlastného výskumu a vedeckých úspechov. Som si vedomý, že inak budem niesť následky v súlade s platnými právnymi predpismi. Ión GÎSCĂ, dátum 125