Chmeľový extrakt (Humulus lupulus) ako fungicíd proti Plasmopara viticola - PDF na stiahnutie zadarmo

Lucia Schreiner Imatrikulačné číslo: 0941576 BOKU Viedeň 2012 Chmeľový extrakt (Humulus lupulus) ako fungicíd proti Plasmopara viticola Diplomová práca Lucia Schreinera Univerzita prírodných zdrojov a biologických vied, Viedeň Katedra aplikovaných vied o rastlinách Vedúci: Prof. Astrid Forneck Zástupca: Dr. Ulrike Anhalt V spolupráci s Weinbauinstitut Freiburg Hlavný vedúci: Dr. Hans- Heinz Kassemeier Zastúpenie: Dr. Karsten Schmidt

Túto prácu venujem svojim rodičom, ktorí mi umožnili štúdium. Poďakovanie: Rád by som poďakoval nasledujúcim ľuďom za priateľskú a nezištnú pomoc pri príprave tejto práce: Fedorovi Löschovi z Freiburgského vinárskeho inštitútu za veľa cenných podnetov z vinohradníckej praxe., Silvii Herzog, Sollemanovi Millerovi a Gerde Willersovej za pomoc pri uskutočňovaní prieskumu, ako aj všetkým zúčastneným manažérom závodu, Dr. Karl Moder za štatistické poradenstvo, moja matka za neohrozenú korektúru pravopisu a Chevon Prince za opravu abstraktu. 2

Obsah 1. Úvod. 11 2. Recenzia literatúry. 13 2.1. Biológia patogénu Plasmopara viticola. 13 2.1.1. Dejiny a význam. 13 2.1.2. Taxonómia. 13 2.1.3. Poškodený obrázok. 14 2.1.4. Primárny cyklus infekcie. 15 2.1.5. Druhý cyklus infekcie. 16 2.1.6. Mechanizmy odolnosti viniča proti Plasmopara viticola. 18 2.2. Ochrana viniča meďou - objav sa stáva výzvou. 22 2.2.1. Vlastnosti medi. 22 2.2.2. Meď ako fungicíd. 23 2.2.3. Riziká používania medi. 24 2.2.4. Využitie medi ako výzva v ekologickom vinohradníctve. 31 2.3. Dlhé hľadanie alternatív. 32 2.3.1. Redukcia medi. 32 2.3.2. Náhrada medi. 2.3.3. Ďalšie možné riešenia problému s meďou. 41 2.4. Chmeľ ako prostriedok na ochranu rastlín. 42 2.4.1. Dejiny a význam. 42 2.4.2. Zloženie chmeľu a chmeľového extraktu. 44 2.4.3. Predchádzajúce použitie chmeľového extraktu ako prostriedku na ochranu rastlín. 45 3. Materiál a metódy. 47 3.1. Materiály. 47 3.1.1. Chemikálie. 47 3

3.1.2. Nástroje a vybavenie na prieskum. 48 3.1.3. Nástroje a prístroje na miešanie chemikálií. 49 3.1.4. Pomôcky a vybavenie pre mikroskopické experimenty. 49 3.1.5. Nástroje a vybavenie pre listové disky a experimenty s listami. 49 3.1.6. Nástroje a vybavenie pre pokusy s celou rastlinou. 51 3.1.7. Nástroje a zariadenia na hodnotenie. 51 3.2. Metódy. 51 3.2.1. Prieskum. 51 3.2.2. Mikroskopické experimenty. 53 3.2.3. Disk s listami a experimenty s listami. 55 3.2.4. Celá rastlina experimentuje. 59 3.2.5. Štatistické hodnotenie. 59 4. Výsledky. 61 4.1. Prieskum o použití medi vo vinohradníctve. 61 4.2. Mikroskopické pokusy o účinnosti chmeľového extraktu. 67 4.3. Pokusy s rastlinným materiálom. 4.3.1. Účinok chmeľového extraktu na listové disky. 79 4.3.2. Liečivý účinok chmeľového extraktu. 83 4.3.3. Translaminárny účinok chmeľového extraktu. 86 4.3.4. Skúmanie účinku chmeľového extraktu na celé rastliny. 88 4.3.4.1. Ak je infikovaný, 0 dní po liečbe. 88 4.3.4.2. V prípade infekcie jeden deň po liečbe. 92 4.3.5. Systémový účinok chmeľového extraktu. 97 4.3.5.1. V prípade infekcie nula dní po liečbe. 97 4.3.5.2. V prípade infekcie jeden deň po liečbe. 100 5. Diskusia. 104 4

6. Záver. 117 7. Abstrakt. 120 8. Zhrnutie. 121 9. Bibliografia. 123 10. Príloha. 146 Zoznam tabuliek Tabuľka 1: Prehľad niektorých doteraz skúmaných dôležitých agentov. 38 Tabuľka 2: Kódovanie správania spór. 54 Tabuľka 3: Výsledky prieskumu o problémoch s P. viticola, príprava medi. 64 Frekvencia použitia, množstvo čistej medi vg/ha a poškodenie meďou, N = 30. 64 Tabuľka 4: Čas použitia medi, N = 30. 66 Tabuľka 5: Lokalizácia problémov s meďou v príslušných farmách, N = 30. 67 Tabuľka 6: Účinok chmeľového extraktu po piatej Zápisnice. 68 Tabuľka 7: Účinok chmeľového extraktu po desiatich minútach. 69 Tabuľka 8: Medený efekt po dvoch minútach. 71 Tabuľka 9: Medená akcia po piatich minútach. 72 Tabuľka 10: Medený efekt po desiatich minútach. 73 Tabuľka 11: Účinok 1 mg medi pri rôznych teplotách. 76 Tabuľka 12: Účinok 0,1 mg medi pri rôznych teplotách. 77 Tabuľka 13: Účinok chmeľového extraktu na listové disky. 79 Tabuľka 14: Účinok medi na listové disky. 81 Tabuľka 15: Liečivý účinok chmeľového extraktu. 85 Tabuľka 16: Translaminárny účinok chmeľového extraktu. 87 Tabuľka 17: Intenzita napadnutia celých rastlín ošetrených chmeľovým extraktom po 0 dňoch. Doba expozície 90 postrekovacieho prostriedku. 90 5

Tabuľka 18: Frekvencia infekcie celých rastlín ošetrených chmeľovým extraktom po 0 dňoch. 91 Čas vstreknutia. 91 Tabuľka 19: Intenzita napadnutia celých rastlín ošetrených chmeľovým extraktom po jednom dni. 94 Čas vstrekovania. 94 Tabuľka 20: Frekvencia napadnutia celých rastlín ošetrených chmeľovým extraktom po jednom dni. 96 Čas vstrekovania. 96 Tabuľka 21: Systémové účinky chmeľového extraktu po 0 dňoch. 98 Čas vstreknutia, úroveň zamorenia. 98 Tabuľka 22: Systémové účinky chmeľového extraktu po 0 dňoch. 99 Čas aplikácie postreku, frekvencia napadnutia. 99 Tabuľka 23: Systémové účinky chmeľového extraktu po jednom dni. 101 Čas vstreknutia, úroveň zamorenia. 101 Tabuľka 24: Systémové účinky chmeľového extraktu po jednom dni. 103 Čas vstrekovania, frekvencia napadnutia. 103 Zoznam obrázkov Obr. 1: Olejové škvrny (zdroj: http://blog.weinbau24.de/wp- content/uploads/oelflecken.jpg) . 14 Obr. 2: Infekčný cyklus (zdroj: Obr. 2: Infekčný cyklus: http://www.rz.unikarlsruhe.de/

db50/forschung_vitis/lifecycle-files/zyklus.jpg). 18 Obr. 3: Fytotoxicita chmeľového extraktu. 44 Obr. 4: Automatické striekacie zariadenie. 50 Obr. 5: Pokusy s listovými diskami. 57 Obr. 6: Testy celého listu. 58 Obr. 7: Problémy s Plasmopara viticola, kódované od 0 (žiadne) do 4 (veľmi veľké). 61 Obr. 8: Priemerné množstvo čistej medi použitej vg/ha. 62 Obr. 9: Priemerná frekvencia používania medi za rok. 62 6

Obrázok 13: Účinok chmeľového extraktu. 108 päť minút, kódované od 0 (žiadny efekt 108) do 5 (spórové výbuchy). 108 Obr. 14: Účinok chmeľového extraktu po. 108 desať minút, kódované od 0,108 (bez účinku) do 5 (spora. 108 dávok). 108 Obr. 41: Komplexy medeného chmeľového extraktu 1. 114 Obr. 42: Komplexy medeného chmeľu 2. 114 Zoznam skratiek Ca. cm Cu Fg ha Ho. Vyd. Kg Km/hl mg Približne centimetre medi Stupeň voľnosti Hektáre vydavateľa chmeľového extraktu Kilogramy hodín kilometrov liter miligramov µg mikrogramu 9

ml WH mililiter opakujte 10

Jedným z prostriedkov proti Plasmopara viticola, ktoré ešte nebolo skúmané, je chmeľový extrakt. Zatiaľ čo chmeľ sa dnes používa predovšetkým v pivovaroch, v staroveku a stredoveku sa častejšie používal ako korenie a liečivo. Fytoterapia znovu objavuje túto rastlinu už niekoľko rokov. Fytomedicín to teraz nasledoval a niektoré fungicídne a insekticídne účinky chmeľového extraktu už boli preukázané. V rámci tradície snáh o nahradenie medi vo vinohradníctve sa táto práca preto zaoberá nasledujúcimi otázkami: Je chmeľový extrakt vhodný na boj s Plasmopara viticola? Naozaj stále hrá vo vinohradníctve dôležitú úlohu použitie medi? Ukázalo sa, že meď je škodlivá? Ak je to tak, je chmeľový extrakt náhradou doplnkov medi? 12

Čeľaď: Plasmopara viticola navyše patrí do čeľade Peronosporaceae povinné parazity, ktoré si svoje sporangie vyvíjajú na nosičoch sporangií a šíria sa vetrom (AGRIOS, 1997, KORTEKAMP, 2001). Rod: Plasmopara viticola patrí do rodu Plasmopara. Zahŕňa 20 druhov špecializovaných rastlinných parazitov. Druh: Celým menom druhu je Plasmopara viticola (Berk. A Curt. Ex de Bary) Berl. & de Toni. alebo peronospóra viniča hroznorodého (AGRIOS, 1997). Je povinne biotrofický, čo znamená, že chov na umelom živnom médiu nie je možný (KORTEKAMP, 2001). 2.1.3. Poškodenie Poškodenie spočiatku pozostáva z okrúhlych, 2–3 cm veľkých, zosvetlených žltozelených škvŕn na hornej strane listu, olejových škvŕn. Neskôr sa na spodnej strane listu objaví biely plesňový trávnik nosičov sporangií podobných stromom. Ako choroba postupuje, ohniská zamorenia sa stávajú nekrotickými zvnútra; ak je zamorenie silné, celý list vädne a padá na zem (SNOEK, 1986). Obrázok 1: Olejové škvrny (zdroj: http://blog.weinbau24.de/wpcontent/uploads/oelflecken.jpg) 14

Obrázok 2: Infekčný cyklus (Zdroj: Obr. 2: Infekčný cyklus: http://www.rz.unikarlsruhe.de/

db50/forschung_vitis/lifecycle-files/zyklus.jpg) 2.1.6. Mechanizmy rezistencie viniča na Plasmopara viticola Zatiaľ čo európsky vinič Vitis vinifera je vysoko citlivý na Plasmopara viticola, existuje veľa rezistentných druhov amerických Vitis (PERTOT ET AL., 2003 b). Divoké hrozno je tiež zjavne odolnejšie ako pestované odrody. Čím je pestované hrozno geneticky bližšie k divému hroznu, tým je odolnejšie (REUTHER, 1961). Nehostiace sa rastliny, napríklad šalát záhradný (Lactuca sativa), môžu zabrániť preniknutiu Plasmopara viticola do bunky. Rezistentné viniče naopak reagujú iba na vznik haustórií (DÍEZ-NAVAJAS ET AL., 2008). Nie je ovplyvnená napríklad akumulácia zoospór na prieduškách (DENZER, 1999). Haustoria sa zdajú byť 18

Záver, že samotná náhrada medi by nebola dostatočná na zabezpečenie trvalej účinnosti (WILBOIS ET AL., 2009). Tabuľka 1: Prehľad niektorých dôležitých látok, ktoré boli doteraz skúmané Účinnosť činidla Zdroj Rastlinné extrakty Elot-Vis (extrakty z konope (kanabis), vtáčej čerešne (Prunus padus) a nechtíka (Calendula officinalis)) Žiadny významný účinok alebo kolísanie MOHNS, 2000, DAGOSTIN ET AL ., 2008; 2011 Milsana (výťažok z kriedovky sachalínovej (Reynoutria sachalinensis)) Žiadny významný účinok MOHNS, 2000 Telmion (repkový olej (Brassica napus)). Žiadny významný účinok MOHNS, 2 000 listov brečtanu (Hedera helix) kôra rakytníka (Frangula alnus) kôra vŕby (Salix spp.) Korene prvosienky (Primula veris) korene rebarbory (Rheum rhabarbarum). Významné, ale príliš málo pre prax Významné, ale príliš málo pre prax Významné, ale príliš málo pre prax Významné, ale príliš málo pre prax Významné, ale príliš málo pre prax KAST, 2003 KAST, 2003 KAST, 2003 KAST, 2003 KAST, 2003 Modré riasy (Laminaria digitata) Liečivé, nízke AZIZ ET AL., 2003 Pomaranč (Citrus aurantium L.) Nestabilný olej LA TORRE ET AL., 2007 38

Willow (Salix spp.) Extrakt kolísajúci DAGOSTIN ET AL., 2008; 2011 Výťažok z čerešne vtáčej (Prunus padus) Výťažok z nechtíka lekárskeho (Callendula officinalis) Šalvia lekárska (Salvia officinalis) Kolísanie Kolísanie Významné, ale pre prax príliš nízke DAGOSTIN ET AL., 2008 DAGOSTIN ET AL., 2008 DAGOSTIN ET AL., 2011 Tymiánový olej (Thymus vulgaris) Nevyhovujúci HARM, 2005 Sezamový (Sesamum indicum) olej Nevyhovujúci HARM, 2005 Kukuričný olej (Zea mays) Nevyhovujúci HARM, 2005 Extrakt z Robinia (Gliricidia sepium) Nevyhovujúci HARM, 2005 Minerály a soli Vodné sklo potaš (kremík) Žiadny významný účinok MOHNS, 2000 MYCO -SIN (kremičitan hlinitý/kys. Alumina) Steinhauerov práškový trus (hydrogénuhličitan sodný) Nízky účinok MOHNS, 2000 Žiadny významný účinok MOHNS, 2000; HOFMANN, 2003 Kyselina fosforečná (H 3 PO 3) kolísajúca WICKS ET AL., 1991 Kolísajúca vápnik LA TORRE ET AL., 2007; DAGOSTIN ET AL., 2011 Magnézium fluktuujúce LA TORRE ET AL., 2007 39

Kolísanie železa LA TORRE ET AL., 2007 Kolísanie draslíka LA TORRE ET AL., 2007 Kolísanie zinku LA TORRE ET AL., 2007 Kolísanie mangánu LA TORRE ET AL., 2007 Kolísanie dusíka LA TORRE ET AL., 2007 Fosfor s nízkym účinkom LA TORRE ET AL., 2007 kolísanie organického vápna LA TORRE ET AL., 2007 kolísanie hliníka a posylu HÄSELI ET AL., 2006 organické látky FZB 24 (Bacillus subtilis) žiadny významný účinok MOHNS, 2000 chitosan kontroverzný AZIZ ET AL., 2006 β-aminomaslová kyselina fluktuujúca COHEN, 2002 saphonín fluktuujúca DAGOSTIN ET AL., 2008 Clonotri (látka na báze mikroorganizmov) Trichodex (látka na báze mikroorganizmov) Kolísajúca fluktuácia DAGOSTIN ET AL., 2008 DAGOSTIN ET AL., 2008 40

3. Materiál a metódy 3.1. Materiály 3.1.1. Chemický chmeľový extrakt: Všetky experimenty týkajúce sa účinnosti chmeľového extraktu sa uskutočňovali so 40% chmeľovým extraktom RV0407-51 od DSM Nutritions. Meď: Na mikroskopické a listové diskové experimenty sa použil hydrát síranu meďnatého (II) spoločnosti Merck. Rýchla a úplná rozpustnosť 5-hydrátov síranu meďnatého (SCHRÖTER, 2001) umožňuje okamžitú rovnomernú distribúciu účinnej látky vo vzorkách. Na experimenty s listovými diskami, listami a celými rastlinami sa použili nasledujúce postreky: Melody Combi: Účinná látka: Iprovalicarb 90 g/kg a Folpet 563 g/kg. Základné úsilie: 0,6 kg/ha Spôsob účinku: liečivý. Folpan: Účinná látka: Folpet 800 g/kg. Základné úsilie: 0,4 kg/ha Účinnosť: ochranná. Pergado: Účinná látka: Folpet 400 g/kg, Mandipropamid 50 g/kg Základné úsilie: 0,8 kg/ha Spôsob účinku: ochranný, translaminárny. Agarový agar: Agarový agar Kobe I, prášok, od Roth. Sila gélu bola 1,5 (1 000 g/cm2) 47

3.1.2. Nástroje a vybavenie pre dotazník Dotazník v nemčine, angličtine a afrikánčine (pozri prílohu). 1) Ako by ste ohodnotili svoje problémy s Plasmopara viticola (peronospóra): 2) Používate medené prípravky proti Plasmopara viticola? Áno Veľmi veľké Veľké Stredné Bezvýznamné Bez problémov Nie 2. a) Ak áno, ako často používate prípravky z medi v priemernom roku? 2b) V akom štádiu bežne používate meď? 2 písm. C). Aké prípravky používate? Vyvinutý kvet Kvitnúce až do uzavretia hrozna Mäkkosť bobúľ (konečné postrekovanie) Až po varovaní 2) Aké množstvo týchto prípravkov používate? 3) Máte problémy s používaním medi (napr. Vysoké koncentrácie medi v pôde)? 3a) Ak áno, ako by ste klasifikovali tieto problémy: Áno Veľmi veľké Nie Veľké Stredné Bezvýznamné Žiadne problémy 3b) Aké sú konkrétne problémy? Pôdne vody víno 48

DAVIDSON, 2008), pozberané listy boli staré okolo jedného až dvoch týždňov. Pre listové testy sa zbierali listy s minimálnym rozmerom 40 × 40 mm. Korkový vrták: Priemer 14 mm Pinzeta: Wironit 5869. Plastové misky: Na listové disky: Square Petri Dish od Greiner Bio-One, 120 x 120 x 17 mm. Pre celé listy: Square Petri Dish od Thermo Scientific s rozmermi 245x 245x 25mm. Pehazell papierové dokumenty od Hartmana. Postrekovač: automatický postrekovač od spoločnosti Schachtner. Rýchlosť vstrekovania 2,5 kmh, vstrekovací tlak 3 bary. Obrázok 4: Automatické striekacie zariadenie Tryska: plochá tryska Teejet 8001 ESV od spoločnosti Schachtner. Zoospores: Plasmopara viticola- kmeň Vinárskeho ústavu Freiburg 50

Klasifikujete tieto problémy?). Negatívum k otázke 3 bolo preto v bode 3a zaznamenané ako žiadne problémy. Možné odpovede na otázku 3a boli kódované takto: 4 3 2 1 0 Veľmi veľké Veľké Stredné Bezvýznamné Žiadne problémy Otázka 3b (Aké sú konkrétne problémy?) Dostal nasledujúci kľúč: 3 2 1 Pôda Voda Víno Kódované odpovede boli v tabuľkách odstránené a štatisticky vyhodnotené. 3.2.2. Mikroskopické experimenty Pre mikroskopické experimenty sa pestovali rastliny Plasmopara viticola zoospores z kmeňa Freiburgského vinárskeho ústavu na kvetináčoch v klimatickej komore. Sporangia sa z infikovaných listov opláchla pomocou Pasteurovej pipety a aqua destillata. Tento roztok potom musel zrieť 20 minút až hodinu, aby sa umožnilo vyliahnutie zoospór. Potom sa do suspenzie pridal roztok medi, takže skutočný obsah čistej medi v konečnom roztoku na podložnom sklíčku bol 0,08 mg/l, 0,07 mg/l, 0,06 mg/l, 0,05 mg/l, 0,04 mg/l, 0,03 mg/l, 0,02 mg/l a 0,01 mg/l. Nakoniec bolo možné pozorovať vplyv medi pod mikroskopom. Smrť zoospór bola rozdelená do nasledujúcich etáp: 53

Tabuľka 2: Kódovanie správania spór Správanie Kód Obrázok Vysvetlenie Zoospóra pláva nedotknutá: 0 Neovplyvnené zoospóry majú väčšinou mandľový tvar a otáčajú sa okolo svojej pozdĺžnej osi. Týmto spôsobom rýchlo a cielene preletia riešenie, pričom rýchlo prekonajú prekážky. Zoospore pláva mierne nepravidelne: Zoospore pláva nepravidelne: Zoospore encystuje seba: 1 z. B. pomalšie alebo menej cielené. 2 točí napr. B. okolo svojej vlastnej priečnej osi bez dosiahnutia akéhokoľvek pohybu vpred. 3 Zhodí bičík a leží tam.