Delécia Tbc1d1 potláča obezitu u myší s deficitom leptínu - medzinárodný vestník

predmetov

abstraktné

Pozadie:

Varianty génu TBC1D1 sa spájajú so znakmi súvisiacimi s obezitou u niekoľkých druhov, vrátane ľudí, myší, králikov a kurčiat. Zatiaľ čo varianty TBC1D1 boli spojené s obezitou u ľudí, narušenie génu Tbc1d1 znížilo telesnú hmotnosť myší. TBC1D1 bol identifikovaný ako regulátor transportu glukózy závislý od inzulínu v kostrovom svale, ale jeho úloha v energetickej homeostáze v obezite zostáva nejasná. Bol skúmaný vplyv deficitu TBC1D1 na energetickú homeostázu, metabolizmus glukózy a lipidov v zavedenom myšom modeli obezity.

Metódy:

Obézny leptín (ob/ob) a Tbc1d1 dvojnásobne deficitné myši (D1KO-ob/ob) boli generované krížením B6 s nadváhou. V. Lep ob/ob myši s chudými myšami s deficitom Tbc1d1 na pozadí C57BL/6J. Samčekom myší, ktoré dostávali buď štandardnú stravu (SD), alebo stravu s vysokým obsahom tukov (HFD), sa nepriama kalorimetria hodnotila na telesnú hmotnosť, zloženie tela, príjem potravy, dobrovoľnú fyzickú aktivitu a výdaj energie. Analyzovala sa glukózová a inzulínová tolerancia, ako aj transport glukózy a oxidácia mastných kyselín v kostrovom svalstve.

Výsledky:

U obéznych myší viedol nedostatok Tbc1d1 k zníženiu hmotnosti SD a HFD. Príjem potravy však zostal nezmenený na SD alebo sa dokonca zvýšil u myší s deficitom Tbc1d1 kŕmených HFD bez akejkoľvek zmeny dobrovoľnej fyzickej aktivity. Napriek významne zníženému transportu glukózy stimulovanému inzulínom a zvýšenej oxidácii mastných kyselín v neporušenom izolovanom kostrovom svale, obézne myši s deficitom Tbc1d1 nevykazovali žiadne významné zmeny v glykémii a glukózovej tolerancii v porovnaní s obéznymi kontrolami. Nepriama kalorimetria ukázala, že obézne myši s deficitom Tbc1d1 mali znížený respiračný kvocient spolu so zvýšeným denným výdajom energie.

Závery:

U obéznych myší s deficitom leptínu nemá nedostatok TBC1D1 žiadny vplyv na stravovacie správanie alebo príjem energie, ale vedie k zvýšenému výdaju energie, zmenenej preferencii energetického substrátu so zvýšenou oxidáciou mastných kyselín a potlačením obezity. TBC1D1 môže hrať evolučne konzervovanú úlohu pri regulácii energetickej homeostázy u stavovcov.

úvod

Materiály a metódy

materiálov

Ľudský rekombinantný inzulín (Actrapid HM Penfill) bol zakúpený od Novo Nordisk Pharma GmbH, Mainz, Nemecko a AICAR (aminoimidazolkarboxamid ribonukleotid) bol zakúpený od Enzo Life Sciences, Loerrach, Nemecko. Rádiochemikálie boli získané od spoločnosti Hartmann Analytic, Braunschweig, Nemecko ([1-14C] -D-manitol, 0,1 mCi ml-1) a od spoločnosti American Radiolabeled Chemicals, St. Louis, MO, USA ([9, 10 (n)) - 3H] palmitová kyselina, 1 mCi ml -1; 2- [1, 2-3H (N)] deoxy-D-glukóza, 1 mCi ml -1).

Generácia obéznych zvierat s deficitom Tbc1d1

Genotypizácia

Genomická DNA z končekov myších chvostov sa izolovala pomocou InViSorb Genomic DNA Kit II (Invitek, Berlín, Nemecko). Myši mali genotyp pre Tbc1d1 (D1KO-Fwd: 5'-CAA-CAT-TCT-GAA-GGC-CTT-CTG-3 ', D1KO-Rev: 5'-TCC-CTG-ACA-AGC-TGA-GT- 3 '; WT-Fwd: 5'-GGA CAA GCA GCTT TCT TGT TT-3', WT-Rev: 5'-TCC TGG TCC AGA AGC GAG-3 ') a pre paralelné (Fwd: 5'- TGT CCA AGA TGG ACC AGA CTC-3 '), Rev: 5'-ACT-GGT-CTG-AGG-CAG-GGA-GCA-3').

Extrakcia RNA a syntéza cDNA

RNA bola extrahovaná z rôznych myších tkanív pomocou QIAzol a RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa pokynov výrobcu. CDNA bola transkribovaná z 2 ug celkovej RNA pomocou reverznej transkriptázy GoScript (Promega, Mannheim, Nemecko) a náhodných hexamérov P (dN) 6 (Roche, Mannheim, Nemecko).

Kvantitatívna PCR v reálnom čase

Kvantitatívna PCR v reálnom čase sa uskutočňovala pomocou sond TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) pre Tbc1d1 (Mm00497989_m1), PrlR (Mm00599957_m1) a pre Actb (FAM-TTG AGA CCT TCA ACA CCC CAG CCA-TAMRA) . MWG, Ebersberg) ako pomocný gén. Analýzy sa uskutočňovali pomocou rýchleho real-time PCR systému 7500 od Applied Biosystems (Applied Biosystems). Dáta sa normalizovali podľa metódy ACt odčítaním hodnoty Ct beta-aktínu od hodnoty Ct cieľového génu. 16

Analýza telesnej hmotnosti, stavby tela a dĺžky tela

Celková telesná hmotnosť sa analyzovala pomocou elektronickej váhy (Sartorius, Göttingen, Nemecko). Zloženie tela (telesný tuk a chudá hmota) sa stanovilo pomocou spektrometra nukleárnej magnetickej rezonancie (Bruker-Minispec NMR analyzátor mq10, Bruker Optics, Ettlingen, Nemecko). Dĺžka tela sa analyzovala meraním dĺžky od nosa po konečník.

Glukóza, testy tolerancie na inzulín

Po celonočnom hladovaní dostali zvieratá orálny bolus glukózy (2 g na kg telesnej hmotnosti, 20% roztok) pomocou sondy. Krvné vzorky sa odoberali z končekov chvosta v rôznych časoch (0, 15, 30, 60 a 120 minút) a hladiny glukózy a inzulínu sa stanovovali, ako je opísané nižšie. Pre test tolerancie na inzulín boli myši nalačno cez noc a intraperitoneálne boli injikované 2 IU inzulínu na kg telesnej hmotnosti. Glukóza v krvi sa stanovila 0, 15, 30 a 60 minút po injekcii.

Krvné parametre

Krvný cukor bol stanovený glukometrom (Contour, Bayer, Leverkusen, Nemecko). Plazmový inzulín bol meraný pomocou ELISA (Insulin Mouse Ultrasensitive ELISA, Alpco, Salem, MA, USA), plazmatické ketónové telieska s automobilovou súpravou Total Ketone Bodies, voľný tuk, kyseliny pomocou systému NEFA-HR 2 (obidve Wako Chemicals, Neuss, Nemecko ). Adiponektín sa analyzoval pomocou súpravy Mouse Adiponectin ELISA (Millipore, Billerica, MA, USA), adipocytokíny IL-6, MCP-1, PAI-1 a rezistín sa analyzovali pomocou súpravy Milliplex MAP, myšieho sérového adipokínu (Millipore) a IGF. -1 s vývojovým systémom DuoSet ELISA (R & D Systems, Abington, UK). Triglyceridy a voľný glycerín sa stanovili pomocou súpravy na stanovenie triglyceridov v sére (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemecko). Všetky parametre plazmy sa stanovili podľa pokynov výrobcu.

Analýza absorpcie glukózy a oxidácie mastných kyselín v izolovaných kostrových svaloch

Myši boli anestetizované a svaly extensor digitorum longus a soleus zo zadných nôh boli opatrne rozrezané. Inkubačné médium pozostáva z bikarbonátového pufru Krebs-Henseleit doplneného 5 mM HEPES a 0,1% hovädzieho sérového albumínu bez mastných kyselín. Inkubácia sa uskutočňovala na vodnom kúpeli (30 ° C) za stáleho plynovania (95% 02/5% C02) a za mierneho miešania. Na stanovenie absorpcie glukózy sa svaly extensor digitorum longus inkubovali 30 minút s 5 mM glukózy a 15 mM manitolu v neprítomnosti alebo v prítomnosti 120 nM inzulínu. Po finálnej inkubácii s 1 mM [3H] 2-deoxyglukózou (2,5 mCi ml -1) a 19 mM [14C] manitolom (0,7 mCi ml -1) po dobu 20 minút boli svaly okamžite tekutý dusík a ľad sa skladovali zmrazené pri -80 ° C. Na stanovenie rýchlosti oxidácie mastných kyselín sa svaly soleus inkubovali v bikarbonátovom pufri Krebs-Henseleit obsahujúcom 5 mM glukózy, 15 mM manitolu, 3,5% hovädzí sérový albumín bez obsahu mastných kyselín, 4 mCi ml -1 [ 3H] palmitát a 600 μM obsahovali neznačený palmitát s 2 mM AICAR alebo bez neho pri 30 ° C počas 120 minút a rádioaktivita sa merala scintilačným počítaním média.

Nepriama kalorimetria

Analýzy respiračného kvocientu a EE boli opísané inde. 7 Stručne povedané, zvieratá prešli adaptačnou fázou 24 hodín pred meraním. Klietky sa umiestnili do klimatickej komory pri 22 ° C a spotreba kyslíka (VO 2) a produkcia oxidu uhličitého (VCO 2) sa sledovali 23 hodín pri prietoku

Kŕmenie-pitie

Príjem potravy a fyzická aktivita sa monitorovali automatizovaným systémom analýzy TSE (typ 302015-c/32, TSE Systems, Bad Homburg, Nemecko). Zvieratá mali voľný prístup k krmivu a senzory vody a hmotnosti na kŕmnych košoch zaznamenávali množstvo krmiva spotrebovaného každým zvieraťom. Fyzická aktivita bola určená infračervenými senzormi.

Analýza Western blotom

Pečeňové triglyceridy

Pečeňové tkanivo sa homogenizovalo v 10 mM tlmivom roztoku fosforečnanu sodného s 1% polyoxyetylén-10-tridecyletánu a 1 mM EDTA pomocou tkanivového lyzéra (Qiagen). Homogenát sa inkuboval 5 minút pri 70 ° C a centrifugoval sa 10 minút pri 16 000 rcf. Pečeňové triglyceridy boli merané v supernatante pomocou súpravy (TRIGS) (Randox, Crumlin, UK), ako je opísané v príručke.

Tkanivový glykogén

Tkanivá sa homogenizovali v 1 M KOH, inkubovali sa 30 minút pri 70 ° C a neutralizovali sa koncentrovanou kyselinou octovou. Bola pridaná amyloglukozidáza (Sigma-Aldrich) a vzorky boli inkubované cez noc pri 37 ° C. Po centrifugácii (10 minút, 2 000 rcf) sa glukóza v supernatante merala s glukózovým alkoholom (Human, Taunusstein, Nemecko) podľa pokynov výrobcu.

Výsledky

Delécia Tbc1d1 vedie k významnému zníženiu telesnej hmotnosti u obéznych myší

delécia

Telesná hmotnosť a zloženie tela WT a D1KO ob/ob myší. ( a ) Telesná hmotnosť, ( ) Celková telesná tuková hmotnosť a ( c ) Chudá telesná hmotnosť samcov myší WT a D1KO-ob/ob chovaných buď na SD alebo HFD. Údaje predstavujú priemery ± sem; n = 17-30 (SD) a n = 6-23 (HFD); * P -1 za 24 h ± 0,054 kJ g -1 za deň) 24 h; D1KO-ob/ob: 1,44 kJ g -1 za 24 h ± 0,09 kJ g -1 za 24 h). Pri kŕmení HFD sa množstvo spotrebovanej potravy významne zvýšilo u štíhlejších myší D1KO-ob/ob v porovnaní so zvieratami WT-ob/ob (WT-ob/ob: 1,32 kJ g -1 za 24 h ± 0, 054 kJ) g -1 za 24 hodín; D1KO-ob/ob: 1,63 kJ g -1 za 24 h ± 0,087 kJ g -1 za 24 h; P = 0, 00015). Okrem toho analýza príjmu potravy u mladších myší vo veku 7 týždňov ukázala podobné výsledky bez významných rozdielov u zvierat kŕmených SD a zvýšenej spotreby potravy u myší D1KO-ob/ob kŕmených HFD Tbc1d1 s deficitom (doplnkový obrázok 2d). .

potláča

Príjem potravy a fyzická aktivita myší WT a D1KO ob/ob. ( a ) Distribúcia TBC1D1 v tkanive u 16-týždňových samcov myší WT-ob/ob, analyzovaná metódou Western blot. ( ) Expresia Tbc1d1 v rôznych mozgových oblastiach obéznych myší WT a D1KO-ob/ob, ako aj v chudých myšiach WT-ob/+ a v kostrových svaloch (M. quadriceps) myší WT a D1KO-ob/ob, ktoré uskutočňovali analyzovala sa kvantitatívna PCR v reálnom čase s beta-aktínom ako génom pre udržiavanie domácnosti. Expresia Tbc1d1 sa normalizovala na expresiu WT myší v kostrovom svale. Myši mali 16 týždňov a kŕmili sa SD; Údaje predstavujú priemery ± sem; n = 6-10. ( c ) Príjem krmiva meraný počas 24 hodín, upravený na celkovú telesnú hmotnosť a ( d Dobrovoľná fyzická aktivita analyzovaná infračerveným žiarením u 15 týždňov starých samcov myší chovaných buď s SD alebo HFD. Údaje predstavujú priemery ± sem; n = 5-11; * P -1 ± 0,032 kJ g -1; D1KO- ob/ob: 2,78 kJ g -1 - 0,032 kJ g -1; P = 0,009) (obrázky 3c - d).

potláča

potláča

Glykemická kontrola WT a D1KO-ob/ob myší. ( a ) Glukóza v krvi 17 týždňov starých samcov myší v postprandiálnom stave na SD alebo HFD. ( ) Glukóza v krvi u 12-týždňových samcov myší kŕmených SD a ( c ) zodpovedajúce hladiny inzulínu v plazme počas perorálneho GTT s 2 g glukózy na kg. ( d ) Glukóza v krvi 14 týždňov starých samcov myší odchovaných na SD s 2 IU inzulínu na kg počas testu tolerancie na intraperitoneálny inzulín. Údaje predstavujú priemery ± sem; n = 5-9; * P3H] 2-deoxy-glukóza v kostrovom svale sa analyzovala tak, ako je opísané. Ako je znázornené na obrázku 5a, obe skupiny s nedostatkom leptínu vykazovali zníženú absorpciu glukózy pri stimulácii inzulínom v porovnaní so štíhlou kontrolou zvierat WT-ob/+ (WT-ob/ob: 4,63 nmol mg -1 za 20 minút ± 0,40 nmol mg -1 za deň) 20 min; WT-ob/+: 6,09 nmol mg -1 za 20 minút ± 0,039 nmol mg -1 za 20 minút; P = 0,079). Myši D1KO-ob/ob však vykazovali významne zníženú absorpciu glukózy stimulovanú inzulínom v porovnaní s myšami WT-ob/ob (WT-ob/ob: 4,63 nmol mg -1 za 20 minút ± 0,40 nmol mg -1 za 20 minút; D1KO-ob/ob: 3,26 nmol mg –1 za 20 minút ± 0,19 nmol mg –1 za 20 minút; P = 0,0019).

delécia

delécia

Vplyv zvýšenej oxidácie mastných kyselín na vývoj telesnej hmotnosti je však kontroverzný. V dvoch nezávislých štúdiách s myšami Acc2 -/- sa navrhlo, že na zvýšenie EE a zníženie telesnej hmotnosti stačí väčší prítok mastných kyselín do mitochondrií. 21, 22 V jednej z týchto štúdií sa ukázalo, že myši Acc2 -/- mali znížené hladiny malonyl-CoA, a preto zvyšovali β-oxidáciu v kostrovom svalstve. 21 V druhej štúdii autori pozorovali zvýšenie EE a pokles telesnej hmotnosti u myší Acc2 -/- a dospeli k záveru, že tieto účinky možno priamo pripísať zvýšenému prísunu mastných kyselín a následnému zvýšeniu oxidácie v mitochondriách. . Naproti tomu nedávna štúdia s myšami Acc2 -/-, ktorú uskutočnili Hoehn a kolegovia 23, nezistila žiadne zmeny v EE alebo telesnej hmotnosti, čo naznačuje, že zvýšená β-oxidácia nemusí stačiť na vysvetlenie účinku supresora obezity na potlačenie obezity. Myši s deficitom leptínu a Tbc1d1.

Obezita koreluje so zníženou citlivosťou na inzulín a naopak sa dá očakávať, že zníženie obsahu telesného tuku vedie k zvýšeniu citlivosti na inzulín. 24 Aj keď myši D1KO-ob/ob s nedostatkom Tbc1d1 s nižším celkovým obsahom telesného tuku ako kontroly boli výrazne chudšie, hladina cukru v krvi sa neznížila. Okrem toho sa u týchto myší významne nezmenila ani glukózová tolerancia ani citlivosť na inzulín, čo naznačuje, že znížené uvoľňovanie glukózy v kostrovom svale myší D1KO-ob/ob s deficitom Tbc1d1 kompenzovalo priaznivý účinok potlačenia obezity na glykémiu u týchto myší. môcť.

Mutácie v TBC1D1 boli tiež spojené s kontrolou telesnej hmotnosti u ľudí. Dve štúdie preukázali súvislosť medzi kódujúcim variantom R125W a indexom telesnej hmotnosti (BMI) u žien náchylných na obezitu, zatiaľ čo polymorfizmy jediného nukleotidu TBC1D1 u mužov a žien EPIC Potsdam našli silnú súvislosť s BMI a obvodom pásu. sa stala kohortou. 10, 11, 25 Zodpovedajúce štúdie na zvieratách u ošípaných, králikov a kurčiat odhalili súvislosť medzi variantmi TBC1D1 a zložením tela a obezitou. 12, 13, 14, 15 Naša súčasná štúdia na obéznych myšiach naznačuje, že TBC1D1 hrá evolučne konzervatívnu úlohu v regulácii telesnej hmotnosti a zloženia stavovcov. Molekulárny základ tohto pozorovania a možný vývojový výber variantov TBC1D1 si vyžadujú ďalšie skúmanie.