Diferenciácia funkčných rolí génovej expresie z imunitných a neimunitných buniek u myší

Zhrnutie

Transplantácia kostnej drene ponúka spôsob, ako zmeniť genotyp buniek pochádzajúcich z kostnej drene. Ak je požadovaný gén exprimovaný tak na bunkách derivovaných z kostnej drene, ako aj na bunkách neodvodených z kostnej drene, transplantácia kostnej drene môže zmeniť bunky odvodené z kostnej drene na iný genotyp bez genotypizácie buniek, ktoré nie sú odvodené z kostnej drene.

Abstrakt

Protokol

A. Technické úvahy skôr, ako začnete

* Stručný popis protokolu o skúške je v ilustrácia 1 zobrazené.

2. Ožarovanie myší prijímačom

  1. Myši sa chovajú a chovajú v patogénnych zariadeniach. Umiestnite myši do autoklávovaného ožarovacieho koláča s filtrami. Vložte myš do každého otvoru ožarovacieho koláča. Dajte koláč na svetlo reflektorov a skontrolujte, či sa otočný tanier a koláč otáčajú.
  2. Zapnite vzduchové čerpadlo na ventiláciu. Zatvorte dvere ohrievača a uzamknite ich.
  3. Ožarujte myši 1 000 radmi (čo zodpovedá 10 Gy) asi 10 minút (v závislosti od zdroja žiarenia a polčasu rozpadu). Od tohto okamihu sú ožarované myši imunokompromitované a majú zlú imunitu proti infekcii. Po ožiarení koláč vyberte a vložte do sterilnej nádoby na prepravu do skrinky na biologickú bezpečnosť zvierat. Nedávajte myši do vonkajšieho prostredia, aby ste minimalizovali možnosť infekcie.
  4. V skrinke na biologickú bezpečnosť preneste myši do autoklávovaných klietok pre myši s autoklávovanými lôžkami (4 myši na klietku. Nová sterilná voda so suspenziou sulfatrimu - 3,12 ml na 100 ml vody).
  5. Fľašu s vodou zabaľte do hliníkovej fólie, pretože antibiotiká sú citlivé na svetlo. Pred vložením do klietky fľašu so sulfatrimom dobre premiešajte.

3. Extrakcia kostnej drene darcu

4. Počítanie buniek darcu kostnej drene

  1. Pridajte 100 μl trypánovej modrej do skúmavky Eppendorf a 100 μl suspenzie kostnej drene do skúmavky Eppendorf a premiešajte. Napipetujte zafarbenú bunkovú zmes do počítacej komory.
  2. Množstvo buniek sa počíta z celkovej životnej plochy počtu buniek kostnej drene v skúmavkách Falcon = počet nezafarbených buniek v 16 štvorcoch x 2 (v dôsledku zriedenia trypánovou modrou) x 10 000 x 50 ml
  3. Centrujte bunky kostnej drene v 50 ml skúmavkách Falcon pri 2 000 ot./min. Počas 5 minút pri 4 ° C.
  4. Odstráňte supernatant. Na základe celkového počtu buniek upravte veľkosť pelety s PBS na 1 x 108 buniek na ml

5. Infúzia recipientných myší

  1. Zahrejte prijímajúce myši na vyhrievacej podložke a pod tepelnou lampou. Umiestnite prijímajúce myši do obmedzovača. 1 x 107 buniek na myš v 100 - 200 μl intravenózne.
  2. Injekcia kostnej drene darcu sa musí vykonať medzi 4 až 24 hodinami po ožiarení.
  3. Prilepte na 4 injekčne podané myši do klietky. Udržiavajte injikované myši v autoklávovaných klietkach s antibioticky upravenou vodou počas prvých 4 týždňov v chove zvierat bez patogénov a nechajte myši znovu získať imunitu. Z dôvodu hygieny vymeňte klietky, vodu ošetrenú antibiotikami a jedlo každé 4 dni.

6. Vyvolávanie kolitídy a hodnotenie kolitídy

7. Kontrola kvality transplantácie kostnej drene pomocou prietokovej cytometrie

  1. Označte každú skúmavku so vzorkou krvi alebo kostnej drene č. 1-5:
  2. Pripravte zmes protilátok pre každú príslušnú skúmavku v tme.

# 1 Žiadna protilátka
# 2 30 ul izotypová kontrola FITC + 30 ul izotypová kontrola PE + 15 ul blokovania CD16/32
# 30 Blokovanie 30 ul FITC CD45.1 Ab + 15 ul CD16/32
4. Blokovanie 30 ul PECD45.2 Ab + 15 ul CD16/32
# 5 Blokovanie 30 µl FITC CD45.1 Ab + 30 µl PE CD45.2 Ab + 15 µl CD16/32

Do vzorky krvi alebo kostnej drene č. 1 nepridávajte nič
Pridajte 5 μl zmesi protilátok # 2 do každej vzorky krvi alebo kostnej drene # 2
Pridajte 3 μl zmesi protilátok # 3 do každej vzorky krvi alebo kostnej drene # 3
Pridajte 3 μl zmesi protilátok # 4 do každej vzorky krvi alebo kostnej drene # 4
Pridajte 5 μl zmesi protilátok # 5 do každej vzorky krvi alebo kostnej drene # 5
  1. Uchovávajte v tme na ľade 30 minút.
  2. 2 ml 1 X RBC lyzačného pufru v každej skúmavke. Udržujte v tme na ľade 15 minút.
  3. Bunky sa centrifugujú pri 1 500 ot./min., 5 minút pri 4 ° C (rotor GH 3,8, 1 500 ot./min = 350 xg). Odstráni sa supernatant. Peleta s 500 μl pufra na farbenie buniek v tme, potom krátko vortexujte.
  4. Pomocou prietokovej cytometrie skontrolujte CD45.1 (ekvivalent k WT) a CD45.2 (KO) vo vzorkách krvi a kostnej drene sfarbenou imunitou. Vyberte FITC, čo predstavuje WT CD45.1, a PE predstavuje KO CD45.2.
  5. Analyzujte výsledky prietokovej cytometrie pomocou softvéru FlowJo. Vypočítajte pomer pomeru FITC: PE alebo pomeru PE: FITC a určte, či je genotyp darcu dominantný v krvi a kostnej dreni.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Ak záujmový gén hrá významnú úlohu v imunitných bunkách pri vývoji kolitídy, myši, ktoré dostávajú kostnú dreň iného genotypu prostredníctvom transplantácie kostnej drene (WT KO alebo KO na WT), by mali mať zmenenú odpoveď na kolitídu DSS. Jedným z najdôležitejších parametrov pri určovaní závažnosti kolitídy je H&E farbenie tkanív hrubého čreva. Zmeny štruktúry hrubého čreva a príznaky zápalu je možné kvantitatívne vyhodnotiť pomocou histologického skórovacieho systému H&E. Kritériá pre hodnotenie histológie H&E pre model DSS Colitis nájdete tu 2. Alternatívne môže byť chemicky indukovaná kolitída vyvolaná aj kyselinou trinitrobenzénsulfónovou (TNBS). Metódy indukcie kolitídy TNBS a kritériá hodnotenia histológie H&E možno nájsť v staršej publikácii 3. Rozdiel skóre histológie medzi skupinami analyzovanými t-testmi študentov.

U myší môže byť významne nadmerne vylepšená alebo zhoršená kolitída u myší s fingovanou transplantáciou kostnej drene (WT WT alebo KO KO). Ak záujmový gén hrá dôležitú úlohu v kolitíde prostredníctvom buniek získaných z kostnej drene, myši s vymenenou kostnou dreňou by mali reagovať významne odlišne od myší s fingovanou transplantáciou kostnej drene.

Pre model kolitídy DSS možno zmenu histológie vyhodnotiť histologickým skóre (pozri Obrázok 4). Významná zmena v histologickom skóre môže byť spôsobená tvorbou kolitídy sprostredkovanou záujmovým génom v bunkách odvodených z kostnej drene. Napríklad kathelizidín je antimikrobiálny a protizápalový peptidový gén (v našom prípade záujmový gén) 4. Bez transplantácie kostnej drene sa u myší s knock-outom u kathelicidínu zvyčajne vyvinula horšia kolitída ako u myší divokého typu v reakcii na DSS. Transfúzia myší divokého typu (WT) s vyradením kathelicidínu (KO) v kostnej dreni vedie k zmierneniu kolitídy, zatiaľ čo transfúzia kostnej drene z myší s vyradením kathelicidínu (KO) do myší divokého typu (WT) vedie k zhoršeniu kolitídy pri liečbe DSS (Obrázok 2) vystavené.

Na potvrdenie expresie záujmového génu by mala byť detekovateľná expresia mRNA záujmového génu (napr. Katehelizidínu) z darcovskej kostnej drene v hrubom čreve (alebo inom) tkanive myší s knock-outom s deficitom katehelizidínu po transplantácii kostnej drene. Je tiež zaujímavé vedieť, či expresia záujmového génu u myší príjemcu divého typu znížila kostnú dreň po darovaní od vyradených myší.

Úspešná transplantácia kostnej drene darcu je predstavovaná dominantným pomerom izotypu CD darcu k izotypu CD príjemcu tak v bunkách periférnej krvi, ako aj v kostnej dreni myší príjemcu. Kostná dreň najlepšie ukazuje značenie CD45.1 a CD45.2 v prietokovej cytometrii, pretože krv má veľa nefarbených buniek (Obrázok 2 a 3).

diferenciácia
Obrázok 1. Protokol experimentu s transplantáciou kostnej drene.

funkčných
Obrázok 2. Údaje prietokovej cytometrie pre myši príjemcov kostnej drene po transplantácii kostnej drene. Osa Y ukazuje signál CD45.1 označený FITC a os X ukazuje signál CD45.2 označený PE. Úspešné štepenie kostí je definované zmenou genotypu CD45.1 alebo CD45.2 v kostnej dreni a krvi recipientných myší. Kliknutím sem zobrazíte väčší obrázok .

funkčných
Obrázok 3. Údaje o prietokovej cytometrii od myší príjemcu krvi po transplantácii kostnej drene. Osa Y ukazuje signál CD45.1 označený FITC a os X ukazuje signál CD45.2 označený PE. Úspešné štepenie kostí je definované zmenou genotypu CD45.1 alebo CD45.2 v kostnej dreni a krvi recipientných myší. Kliknutím sem zobrazíte väčší obrázok .

rolí
Obrázok 4. Vyhodnotenie kolitídy u myší po transplantácii kostnej drene. (A) Vzorky H&E obrazov hrubého čreva v dôsledku normálnej histológie a DSS kolitídy. (B) Histologické skóre. Úspešnú indukciu DSS kolitídy možno potvrdiť významným zvýšením histologického skóre do 5. dňa liečby DSS. Po výmene kostnej drene za iný genotyp by sa malo histologické skóre významne zmeniť. To naznačuje zmenený priebeh kolitídy spôsobený expresiou záujmového génu v bunkách odvodených z kostnej drene. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka priemeru.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Tento prístup k transplantácii kostnej drene je vhodný na imunologický výskum kolitídy, infekcií, rakoviny, obezity a iných chorôb. Tento experiment s transplantáciou kostnej drene je potrebný, keď je záujmový gén exprimovaný v bunkách kostnej drene aj v bunkách neodvodených z kostnej drene a existuje podozrenie, že záujmový gén sprostredkuje ochorenie bunkami z ktorejkoľvek populácie. Napríklad sa ukázalo, že antimikrobiálny peptid katelizidín moduluje akútnu kolitídu. Ale je exprimovaný v epitelových bunkách aj v imunitných bunkách (makrofágy). Potom máme kostné štepy, ktoré určujú, ktorá populácia buniek moduluje akútnu kolitídu u myší. Závažnosť kolitídy sa významne zmenila po zmene genotypu kathelizidínu v kostnej dreni pomocou transplantácie kostnej drene. Potom môžeme dospieť k záveru, že katehelizidín exprimovaný v bunkách odvodených z kostnej drene hrá významnú úlohu pri modulácii akútnej kolitídy v reakcii na DSS.

Na druhej strane existuje veľa spôsobov, ako sledovať úspech pri transplantácii kostnej drene. Analýza prietokovej cytometrie genotypov CD45.1 a CD45.2 môže byť kvantitatívnou metódou na stanovenie podielu kmeňových buniek darcovskej kostnej drene u myší príjemcu. Bunky odvodené z kostnej drene je možné diferencovať na niekoľko typov buniek 10. Ak analýza prietokovou cytometriou nie je možná, je možné použiť samčie (chromozómové XY) myši a samičie (chromozómové XX) myši 11. Darcovské myši nesú jedinečné chromozómy Y v tele samíc myší, ktoré dostávali iba XX. Chromozóm Y možno identifikovať pomocou fluorescenčnej in situ hybridizácie 11. Okrem toho môže byť na vizualizáciu buniek získaných z kostnej drene darcu potrebná imunohistochémia CD45.1, CD45.2 a/alebo požadovaného génu v tkanivách.

Ale po usmrtení myší sa obvykle uskutočňujú prietokové cytometrické analýzy CD45 a hybridizačné postupy in situ chromozómu Y. Na sledovanie polohy darcovských buniek u recipientných myší použitých na sledovanie chronických chorôb, ako je rakovina, bez vyšetrenia myší, je možné ako darcovské myši použiť zelené transgénne myši s fluorescenčným proteínom12. Preto je možné bunky odvodené z darcovskej kostnej bunky vystopovať do tela recipientných myší pomocou neinvazívneho optického zobrazovania s vysokým rozlíšením v dočasnej anestézii, čo je možné vykonať opakovane.

Nie všetky myši majú úspešné transplantácie kostnej drene 13. Pozorovali sme,

10 - 20% myší uhynie na anémiu alebo infekciu v prvých 2 týždňoch po ožiarení. Preto by sa na začiatku experimentu malo vyrobiť viac myší, ako je potrebné. Mali by ste napríklad pripraviť 10 myší na skupinu na začiatku experimentu, ak očakávate 8 myší na skupinu do konca experimentu s kolitídou. Takže uistite sa, že mŕtve myši čo najskôr odstránite. Rýchlosť imunitnej rekonštitúcie koreluje s počtom krvotvorných kmeňových buniek v kostnej dreni infundovaných myšiam príjemcu 14. Preto je rozhodujúce mať dostatočný počet živých buniek kostnej drene (1 x 107 buniek na myš) nalievaných do recipientných myší pre úspešnú transplantáciu kostnej drene.

Príjemcom myší po ožiarení bola znížená imunita. Postupy pitvy darcovských myší a prípravy kostnej drene by sa mali vykonávať na rovnakom štandarde ako experimenty s bunkovými kultúrami. Aseptické podmienky by sa mali vykonávať pomocou sterilných nástrojov a nádob. Pri všetkých experimentoch obsahuje PBS 1% penicilín-streptomycín a pri manipulácii s knedľami sa má použiť 10 U/ml heparínu. Všetky činidlá sú určené pre bunkovú kultúru. Ďalšiu technickú diskusiu nájdete v odkaze 13.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Zverejnenie

Neboli vyhlásené žiadne konflikty záujmov.

Poďakovanie

Táto práca bola financovaná z grantu na pilotnú štúdiu uskutočniteľnosti od centra UCLA-CURE, ceny za kariérny rozvoj pre Crohnovu chorobu a kolitídu v Amerike (č. 2691) a z financovania NIDDK K01 (DK084256) pre Hon Wai Koon.

Operáciu ožarovania kostnej drene podporili Bernard Levin a Scott Kitchen z UCLA Center for AIDS Research Mouse/Human Chimera Core Facility. Prevádzku prietokovej cytometrie podporovalo zariadenie UCLA Vector Core.