Dizertačná práca na získanie akademického titulu

Haplotypy génu pre receptor vitamínu D ako faktory citlivosti na kolorektálny karcinóm, ako aj in vitro analýza expresie génov regulovaných pre vitamín D Dizertačná práca na získanie akademického titulu doktor prírodných vied (Dr. rer. Nat.), Predložené na Katedre biológie, Chémia, lekáreň na Slobodnej univerzite v Berlíne, ktorú predstavila Jana Flügge z Greifswaldu, november 2008 1. Recenzent: Prof. Dr. Matthias F. Melzig 2. recenzent: Prof. Dr. Spor o spoločnosť Ivar Roots 26. februára 2009

práca

Poďakovanie, ktoré sa stanovili, vykonali a vyhodnotili v testoch SNPlex. Osobitne by som sa chcel poďakovať Dipl. Biol. Sabrine Klare za vykonanie SNPlex, Dr. Vyriešte Krusekopf za založenie a hodnotenie SNPlex a pani Anne Sülflowovej a pani Dipl. Biol. Kristin Krostitzovej za postupnosť 3 SNP. Tento doktorát bol finančne podporený Federálnym ministerstvom školstva a výskumu (projekt InnoRegio, číslo grantu 03I4507, farmakogenomická optimalizácia farmakoterapie a subprojektový karcinóm hrubého čreva) a Investitionsbank Berlin (projekt ProFIT, grantové číslo 1013 3117, individuálne rizikové faktory pre karcinóm hrubého čreva, s prihliadnutím na testy polymorfnej genetickej asociácie) mutácií). Chcel by som sa poďakovať svojim rodičom, Dr. Dipl.-Ing. Frank Flügge a Dipl.-Ing. Evelyn Flüggeová, moja sestra Dipl.-Chem. Susanne Flüggeová, moja stará mama Herta Flüggeová a moji starí rodičia Günter Buckow a Christel Buckow vyjadrujú svoju cennú podporu počas celej doby môjho učňovského pobytu, od školy, cez moje štúdium až po doktorát, a za podporu a povzbudenie vo všetkých vzostupoch i pádoch Job. II

Obsah Obsah Poďakovanie. I Obsah. III Zoznam skratiek. VII 1 Úvod. 1 1.1 Kolorektálny karcinóm. 1 1.1.1 Výskyt a úmrtnosť. 1 1.1.2 Patogenéza sekvencie adenóm-karcinóm. 1 1.1.3 Individuálne a environmentálne rizikové faktory, dispozícia a expozícia. 2 1.1.4 Genetické faktory a predispozícia. 4 1.2 Vitamín D. 5 1.2.1 Vlastnosti. 5 1.2.2 Metabolizmus vitamínu D. 6 1.2.3 Vzťah medzi vitamínom D a kolorektálnym karcinómom. 7 1.3 Receptor vitamínu D. 8 1.3.1 Štruktúra, štruktúra a výskyt. 8 1.3.2 Prevádzkový režim. 10 1.3.3 Polymorfizmy génu pre receptor vitamínu D, asociácie a molekulárna charakterizácia. 11 1.3.4 Poly (A) mikrosatelit receptora vitamínu D. 12 1.3.5 Polymorfizmy génov zapojených do metabolizmu vitamínu D. 13 1.4 Vydanie. 14 2 Materiál a metódy. 15 2.1 Materiály. 15 2.1.1 Štúdiové populácie. 15 2.1.2 Bunkové línie. 18 2.1.3 Zariadenia. 18 2.1.4 Chemikálie. 20 2.1.5 Riešenia. 23 2.1.6 Spotrebný materiál. 23 III

Obsah 3 výsledky. 57 3.1 Polymorfizmy génov VDR. 57 3.1.1 Klinické údaje. 57 3.1.2 Výsledky genotypizácie. 58 3.1.3 páry genotypov VDR. 59 3.1.4 Nevyváženie väzby VDR. 60 3.1.5 VDR haplotypov. 61 3.1.6 Poly (A) mikrosatelit receptora vitamínu D. 63 3.2 Polymorfizmy génov zapojených do metabolizmu vitamínu D. 67 3.2.1 Klinické údaje. 67 3.2.2 Výsledky multiplexovej analýzy. 68 3.2.3 Korelácie genotypov. 72 3.2.4 Spojovacia analýza. 72 3.2.5 Komplexné genotypy a haplotypy. 74 3.3 Analýza génovej expresie pomocou RT-PCR. 77 3.3.1 Indukčné experimenty (diferenciačný model). 77 3.3.2 Relatívna kvantifikácia mrna. 78 3.3.3 Expresia génu VDR v bunkách Caco-2. 79 3.3.4 Expresia génu CDH1 v bunkách Caco-2. 80 3.3.5 Expresia génu VDR v bunkách SW480. 81 3.3.6 Expresia génu CDH1 v bunkách SW480. 82 3.4 Analýza génovej expresie pomocou mikročipov GeneChip. 83 3.4.1 Klastrová analýza. 83 3.4.2 Analýza dát regulovaných génov (úrovne bezpečnosti). 84 3.4.3 Priradenie regulovaných génov. 85 3.4.4 Bodový diagram. 85 3.4.5 Hierarchická klastrová analýza. 86 3.4.6 Analýza vybraných génov regulovaných vitamínom D. 88 4 Diskusia. 92 4.1 Polymorfizmy génov VDR. 92 4.1.1 Vplyv polymorfizmov génu pre receptor vitamínu D na citlivosť na kolorektálny karcinóm (štúdia prípadovej kontroly). 92 V

Obsah 4.1.2 Vplyv väzbovej nerovnováhy, komplexných genotypov a haplotypov. 95 4.2 Polymorfizmy génov zapojených do metabolizmu vitamínu D. 100 4.3 Analýza génovej expresie. 4.3.3 Interpretácia výsledkov analýzy génovej expresie pomocou RT-PCR po indukcii v bunkových kultúrach (diferenciačný model). 103 4.3.2 Technické problémy a prenosnosť. 4.3.3 Výber referenčných a kandidátskych génov. 4.3.4 Kontrola kvality a analýza dát výsledkov microarray. 106 4.3.5 Expresia VDR a CDH1 po analýze microarray. 4.3.6 Interpretácia výsledkov analýzy génovej expresie pomocou mikročipu GeneChip. 107 4.3.7 Model regulácie génov vitamínom D. 112 4.4 Výhľady a perspektívy. 113 5 Zhrnutie. 114 6 Bibliografia. 118 7 Zoznam publikácií. 132 životopisov. 134 Čestné vyhlásenie. 135 VI

Zoznam skratiek Zoznam skratiek Skratka Acc. Č. ACTB ATRA β-me bp BMI BSA CDH1 CDS CI crna CV CYP CYP24A1 CYP27A1 CYP27B1 d ddntp DMEM DMSO DNA dntp dsdna EDTA EtOH fcrna FCS Význam Prístupové číslo beta-aktín kyselina beta-aktívna kyselina beta-merkaptoetanolová báza Index telesnej hmotnosti hovädzí sérový albumín Sekvencia kódujúca E-kadherín Interval spoľahlivosti komplementárna RNA Variačný koeficient Cytochróm P-450 Cytochróm P-450 24A1 (cytochróm P450, rodina 24, podrodina A, polypeptid 1), vitamín -D 3-24-hydroxyláza cytochróm P-450 27A1 (cytochróm P450, rodina 27, podrodina A, polypeptid 1), vitamín D 3-25-hydroxyláza cytochróm P-450 27A1 (cytochróm P450, rodina 27, podrodina B), Polypeptid 1), 25-hydroxyvitamin-D 3-1-alfa-hydroxyláza deň 2,3-dideoxynukleotid Dulbecco s Modifikované Eagleho médium dimetylsulfoxid deoxyribonukleová kyselina deoxyribonukleotid 5-trifosfát dvojvláknová DNA etyléndiamín tetraacetát etanol fragmentovaný komplementárna RNA plod m (fetálne teľacie sérum) VII

Zoznam skratiek g g GAPDH gdna Gl. h hap hm ht HWE kap. kb KG LD M MAF MES mrna mut MW n N.A. NaB NaCl n.d. NR n.s. nt OD OR PBS PCR QC akcelerácia v dôsledku gravitácie gramy glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza genomická DNA rovnica hodina haplotyp homozygot heterozygot Hardy-Weinbergova rovnováha kapitola kilobáza páry komplexné genotypy väzbová nerovnováha (väzbová nerovnováha) menšia kyselina alkaliálová 2 RNA (messenger RNA) mutovaná stredná hodnota veľkosť vzorky neuvedená butyrát sodný chlorid sodný nezistiteľné nukleárne receptory nevýznamné nukleotidy optická hustota pomer pravdepodobnosti fosfátom pufrovaný soľný roztok polymeráza kontrola kvality VIII

Zoznam skratiek r Korelačný koeficient RAR receptor kyseliny retinovej RNA ribonukleová kyselina RFLP dĺžka reštrikčného fragmentu polymorfizmus RLT pufor, obsahuje vysoko denaturujúci guanidínizotiokyanát (GITC) otáčky za minútu (otáčky za minútu) ROH retinol rrna ribozomálna RNA RT-reverzný prepis Svedberg (jednotka, sedimentačný koeficient) SD štandardná odchýlka (štandardná odchýlka) s sekundy ssdna jednovláknová DNA (jednovláknová) SNP jednonukleotidový polymorfizmus Taq Thermus aquaticus TBE Tris-borát-EDTA pufor TE Tris-EDTA pufor Tris Tris- (hydroxymetyl ) -aminometán trna transfer-RNA U jednotka, jednotka UV ultrafialové svetlo VDR receptor vitamínu D s divokým typom 1α, 25 (OH) 2 D 3 vitamín D, 1,25-dihydroxyvitamín D 3, kalcitriol 3 -, 5 -UTR 3 -, 5-neprekladaná oblasť 7-DHC 7-dehydrocholesterol IX

Materiál a metódy poskytované inštitútom ggmbh i.gr., Berlín-Hennigsdorf. Prehľad charakteristík nádoru a klasifikácia TNM je uvedená v tabuľke 3. Tabuľka 3 Umiestnenie nádoru, histológia nádoru a klasifikácia TNM u 452 pacientov s rakovinou hrubého čreva (skupina II) Umiestnenie nádoru n% Caecum 32 7,1 Vzostupné hrubé črevo 51 11,3 Priečny hrubý črevo 26 5,8 Zostupné hrubé črevo 16 3,5 Sigmoidné hrubé črevo 102 22,6 Rektum 214 47,3 Iné 11 2,4 Histológia nádoru Adenokarcinóm 414 91,6 Mucinózny adenokarcinóm 28 6,2 Iné 10 2,2 Stupeň diferenciácie Slabé 78 17,2 Stredné 330 73,0 Dobrý 31 6,9 Nediferencovaný 13 2,9 Nádorové štádium (pt) pt1 Submukóza 22 4,9 pt2 Muscularis propria 109 24,1 pt3 Subserosa 267 59,1 pt4 Ostatné orgány/perforácie 54 11,9 Metastázy lymfatických uzlín (pn) pn0 Žiadna metastáza 211 46,7 pn1 1-3 lymfatické uzliny 126 27,9 pn2 4 alebo viac lymfatických uzlín 102 22,5 Ostatné 13 2,9 Vzdialené metastázy (pm) pm0 Žiadne vzdialené metastázy 346 76,6 pm1 Vzdialené metastázy 100 22,1 Ostatné 6 1,3 Kontrolná skupina pozostávali z pacientov s nezhubnými ochoreniami. Vzorky zhromaždil Ústav pre klinickú farmakológiu a toxikológiu pri Charité Universitätsmedizin Berlin. Všetci účastníci štúdie boli informovaní o obsahu a cieľoch štúdie a udelili písomný súhlas. 17