Dizertačná práca za získanie doktorátu na chemickom oddelení

1 Stanovenie produktov rádiolýzy aminokyselín orto-tyrozínu a kyseliny 3- (4-hydroxyfenyl) propiónovej ako dôkaz γ-ožarovania potravín bohatých na bielkoviny DISTRENTNÁ ČINNOSŤ pre získanie doktorandského titulu na Katedre chémie na univerzite v Hamburgu z Ústavu pre biochémiu a chémiu potravín - Katedra chémie potravín na univerzite v Hamburgu predstavila Jana Huňková z Kladna Hamburg 23

získanie

2 Táto práca sa uskutočnila v období od októbra 1998 do 22. septembra pod vedením profesora Dr. DR. Hans Steinhart na Ústave pre biochémiu a chémiu potravín - odbor Chemikálie pre potraviny. 1. recenzent: Prof. Dr. DR. Hans Steinhart 2. recenzent: Prof. Dr. Bisping

3 Poďakovanie Na tomto mieste by som chcel poďakovať všetkým, ktorí ma podporili pri príprave tejto diplomovej práce: Prof. Dr. DR. Chcel by som poďakovať Hansovi Steinhartovi za poskytnutie témy a veľkú podporu. Prof. Dr. Ďakujem Bispingovi za prevzatie prezentácie. DR. Rád by som poďakoval Thomasovi Simatovi za jeho neustálu ochotu diskutovať a spolupracovať, čo prispelo k úspechu tejto práce. Chcel by som poďakovať všetkým kolegom z Katedry chémie potravín na univerzite v Hamburgu za dobrú spoluprácu. Chcel by som sa poďakovať spoločnostiam Beiersdorf AG a GAMMASTER GmbH za ožiarenie vzoriek. Ďakujem spoločnosti Daimler-Benz a Nadácii H. Wilhelma Schaumanna za finančnú podporu tejto práce. Ďakujem svojim rodičom za ich nevyčerpateľnú trpezlivosť. Chcel by som poďakovať svojim priateľom Ruth, Jiřímu, Robertovi, Britte, Astrid, Kerstinovej, Lui a Marijane za vykonanie nápravy a ďalšiu rôznorodú podporu.

4 Zoznam skratiek 4 Zoznam skratiek 3,2-HPPA 3,3-HPPA 3,4-HPPA λ Ex λ Em AP-ESI BgVV CV Em ESR EU Ex FAO FIA FL FLD GC HCl HPLC IAEA IS kgy LMBG M m/z MeCN MeOH min MS MSD MW n Kyselina 3- (2-hydroxyfenyl) -propiónová Kyselina 3- (3-hydroxyfenyl) -propiónová Kyselina 3- (4-hydroxyfenyl) -propiónová Excitačná vlnová dĺžka Emisná vlnová dĺžka Atmosférický tlak Elektrosprej Ionizácia Federálny inštitút pre ochranu zdravia spotrebiteľa a veterinárne lekárstvo Variačný koeficient emisie Elektrónová spinová rezonančná spektroskopia Európska únia a organizácia pre poľnohospodárstvo Analýza prietokovej injekcie Fluorescencia Detekcia fluorescencie Plynová chromatografia Kyselina chlorovodíková Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia Medzinárodná agentúra pre atómovú energiu Interný štandard Kilo Gray Zákon o potravinách a komoditách Molekulový hmotnostný pomer Hmotnosť za poplatok Acetonitril Metanol Minúty Hmotnostná spektrometria Hmotnostná selektívna detekcia Priemerný počet vzoriek

5 Zoznam skratiek 5 n.n. n.b. NH 4 octan NH 4 mravčan NWG PE Phe RP RT SIM SPE TFA TL Tyr UV v/v WHO WFR nezistiteľný neurčený neurčený detekčný limit octanu amónneho amónneho mravčanu polyetylén fenylalanín reverzná fáza izbová teplota jediný ión extrakcia tuhá fáza kyselina trifluóroctová termoluminiscencia objemový pomer tyrozínu ultrafialové

6 Obsah 6 Obsah 1 ÚVOD CIEĽ TEORETICKÉ ZÁSADY Ožarovanie potravín Chemické účinky ionizujúceho žiarenia Primárny účinok ožiarenia Sekundárny účinok ožiarenia Vplyv dávky ožiarenia Vplyv dávky dávky Vplyv teploty dávky počas ožarovania Zmena jedla počas mrazenia MATERIÁL Krevety Zasklenie Kuracie mäso VÝVOJ METÓD NA STANOVENIE O-TYROZÍNU Optimalizácia chromatografických podmienok Optimalizácia detekcie Fluorescenčná detekcia (FLD) Hromadná selektívna detekcia (MSD) Vývoj čistenia Deproteinizácia Homogenizácia Izolácia o-tyru extrakciou na pevnej fáze Diskusia VÝVOJ METÓD PRE 4. STANOVENIE -HYDROXYPHENYL) -PROPIONOVÁ KYSELINA Optimalizácia chromatografických podmienok. 43

7 Obsah Optimalizácia detekcie Vývoj čistenia Deproteinizácia Izolácia a obohatenie kyseliny 3- (4-hydroxyfenyl) propiónovej extrakciou kvapalina-kvapalina Izolácia a obohatenie kyseliny 3- (4-hydroxyfenyl) propiónovej extrakciou pevnou fázou Validácia Diskusia STANOVENIE FENYLALANÍNU A P-TYROZÍN V BOHATÝCH PROTEÍNOVÝCH POTRAVINÁCH STANOVENIE O-TYROZÍNU V Y-ožarovanom BOHATOM PROTEÍNOVOM VPLYVE Vplyv teploty Stanovenie o-tyrozínu pri RT ožarovaných potravinách bohatých na bielkoviny Stanovenie o-tyrozínu v mrazených, na ožarovaných potravinách bohatých potravinách Vplyv dávkového príkonu Vplyv dávkového príkonu ožarovania - zasklenie obsahu o-tyrozínu v pozadí v neožiarených vzorkách Vzťah medzi obsahom fenylalanínu a radiačne indukovanou tvorbou o-tyrozínu STANOVENIE KYSELINY 3- (4-HYDROXYPHENYL) -PROPIONOVEJ V γ-ožiarených PROTEÍNOVÝCH - POTRAVINÁCH obsah p-tyrozínu a tvorba kyseliny 3- (4-hydroxyfenyl) propiónovej vyvolaná žiarením DISKUSNÝ SÚHRN - SÚHRN Súhrnné zhrnutie LITERATÚRA. 82

9 Obsah Aniónové výmenníky Validácia procesu na stanovenie kyseliny 3- (4-hydroxyfenyl) propiónovej Stanovenie kyseliny 3- (4-hydroxyfenyl) propiónovej v potravinách bohatých na y-ožarované bielkoviny Výsledky γ-ožarovania potravín Stanovenie 3- (4-hydroxyfenyl) - chromatogramy kyseliny propiónovej. 125

14 1 Úvod 14 rovnaké oxidačné produkty reagujú. Nový prístup k identifikácii y-ožiarených potravín bohatých na bielkoviny a zároveň nízkotučných potravín ponúka určenie nového potenciálneho radiačného markera 3,4-HPPA. Na základe skríningu KLEEBERG (22) objavil tento produkt aminokyseliny pre rádiolýzu v rôznych potravinách bohatých na y žiarením, ako sú krevety v Severnom mori, kuracie prsia a ďalšie druhy kreviet. Tento radiačný marker bol detegovateľný tak pri izbovej teplote, ako aj v mrazených ožarovaných potravinách. Boli zistené významné rozdiely medzi hladinami 3,4-HPPA v neožiarených a ožarovaných vzorkách. 3,4-HPPA sa stanovil pomocou HPLC/FLD. Tento postup ešte nebolo možné použiť ako rutinný postup.

16 3 Teoretické základy 16 3 Teoretické základy 3.1 Ožarovanie potravín Na ožarovanie potravín sú povolené tri rôzne typy žiarenia (CODEX ALIMENTARIUS, 1984): γ-lúče rádionuklidov 6 Co (sú umelo vyrábané z 59 Co, dve γ-kvantá s emitované s energiou 1,17 MeV a 1,33 MeV) γ-lúče rádionuklidov 137 Cs (z jadrového štiepenia sa emituje γ-kvantum s relatívne nízkou energiou 0,66 MeV) β-lúče až do energie Röntgenové lúče 1 MeV (sekundárne žiarenie z urýchľovača elektrónov) až do energie 5 MeV. Na ožarovanie potravín sa najčastejšie používajú γ-lúče, ktoré majú v porovnaní s β lúčmi vysokú penetračnú kapacitu pre látku, a preto sa dobre hodia na ožarovanie výrobkov na paletách (DIEHL, 1995). V závislosti od oblasti použitia žiarenia sa používajú rôzne dávky žiarenia od 0,5 do 1 kg. Rozsah vysokých dávok viac ako 1 kg nie je schválený pre komerčné potraviny, ale používa sa na špeciálne účely na sterilizáciu. Niektoré oblasti použitia s maximálnymi povolenými dávkami žiarenia sú uvedené v tabuľke 2 (IAEA, 2).

18 3 Teoretické princípy 18 rádiolyticky rozdelené, pričom v zásade sa vyskytujú nasledujúce produkty rádiolýzy (Rov. 4) (DRAGNIC and DRAGNIC, 1963, VON SONNTAG, 1987, DODD, 1995): H 2 O OH + e - aq + H + H 3 O + (Rov. 4) Sekundárny účinok žiarenia Voľné radikály tvorené primárnym účinkom ionizujúceho žiarenia sú veľmi reaktívne a môžu reagovať navzájom alebo s prísadami potravín, čo vedie k sekundárnym produktom žiarenia. Výsledné druhy môžu pokračovať v reakcii nasledovne (Rov. 5, 6, 7): Kombinácia R + H RH (Rov. 5) R + R RR dimerizácia (Rov. 6) RH + + e - aq RH elektrónový záchyt (Rov. 7) ) Hydroxylové radikály ako primárne produkty rádiolýzy vody majú silný oxidačný účinok. Sú obzvlášť reaktívne voči nenasýteným zlúčeninám a zlúčeninám s aromatickými kruhmi (KARAM a SIMIC, 1989, WANG et al., 1993). Keď OH radikál napadne Phe, dôjde k prídavku k aromatickému kruhu, pričom sa vytvoria štyri možné medziprodukty (obrázok 1). Tri z nich (1, 2, 3) vedú k tvorbe hydroxy-Phe, zatiaľ čo forma Ipso (4) vedie k neznámym produktom (WANG et al., 1993). Obrázok 1: Tvorba hydroxy-Phe radikálov prostredníctvom primárnych a sekundárnych účinkov

23 3 Teoretické základy 23 Normalizácia tráviacich funkcií v (GUTSCHMIDT, 1964). Enzymaticky voľné mastné kyseliny sa uvoľňujú z lipidov. Ich tvorba je závislá od teploty a pri nižších teplotách pomalšia ako pri vyšších. Enzýmy sa zvyčajne procesom zmrazenia nezničia. Keď teplota stúpne, môžu byť opäť úplne aktívne. Enzýmy kaziace tuky, napr. Lipázy a lipoxidázy sú stále aktívne aj pri nízkych teplotách a vedú k tvorbe produktov rozkladu tukov (aldehydy, ketóny, kyseliny, peroxidy) a k rozkladu fosfatidov (HERRMANN, 197).

31 5 Vývoj metód na stanovenie o-tyrozínu 31 3 Vlnová dĺžka (nm) excitácia maximálna emisia maximálna hodnota ph Obrázok 5: Vplyv hodnoty ph na excitáciu a emisné maximum Optimalizácia intenzity fluorescencie Fluorescenčné vlastnosti Tyrových izomérov závisia od hodnoty ph . Z tohto dôvodu bol skúmaný vplyv hodnoty pH pufra na fluorescenčnú intenzitu o-tyru a tým aj na citlivosť detekcie. Na tento účel sa o-tyrové roztoky vo fosfátovom tlmivom roztoku s hodnotami pH medzi 1,5 a 9,3 merali fluorimetricky (Aex = 275 nm, Aem = 35 nm). Zistilo sa, že intenzita fluorescencie dosahuje maximum v rozmedzí pH 4 až 5 (obrázok 6). Hodnota intenzity fluorescencie (%) ph Obrázok 6: Závislosť intenzity fluorescencie o-tyru od hodnoty ph Nasledujúci postup sa použil na prenos výsledkov, ktoré sa dosiahli pomocou fosfátového pufru, do testovaných mobilných fáz. O-tyrové riešenie v tom, ktoré vyvinuli HEIN a kol. (2) použité elučné činidlo, 1% TFA (pH 1,8) sa tiež meral fluorimetricky (Aex = 275 nm, Aem = 35 nm). O-tyr sa tiež skúmal v roztoku 0,5 mol/l NH4 mravčanu pri pH 3, 4 a 4,5. Maximálna intenzita fluorescencie sa získala s roztokom o-tyru v tlmivom roztoku NH4 pri pH 4