Dvojité priame vstreknutie krvi do Cisterna Magna ako model subarachnoidálneho krvácania

Zhrnutie

V tomto protokole sme opísali štandardizovaný model subarachnoidálneho krvácania (SAH) dvojitou injekciou celej autológnej krvi do cisternovej magny. Vysoký stupeň štandardizácie procesu dvojitej injekcie predstavuje stredný až akútny model SAH s relatívnou istotou úmrtnosti.

dvojité

Abstrakt

Úvod

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Všetky postupy sa uskutočňovali pod dohľadom H. Castela v súlade s Francúzskym etickým výborom a usmerneniami smernice Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ o ochrane zvierat používaných na vedecké účely. Tento projekt bol schválený miestnym CENOMEXA a národnými etickými komisiami pre výskum a testovanie na zvieratách. Samce myší C57Bl/6J Rj (Janvier) vo veku 8 - 12 týždňov boli chované za štandardných kontrolovaných podmienok prostredia: 22 ° C pri 1 ° C, cyklus 12 hodín/12 hodín svetlo/tma a voda a jedlo ad libitum.

1. Pripravte chirurgický zákrok na SAH a pripravte sa na injekciu

Príprava druhého zvieraťa (8 - 10 týždňov staré myši C57BL/6J)

3. Indukcia SAH

4. Pooperačné sledovanie a koniec experimentu

  1. Ihneď po operácii izolujte a umiestnite myš s dekubitovým vredom s prikrývkou na prežitie na chrbte do otvorenej škatule počas zotavovania.
  2. Každý deň vážte a sledujte správanie každej myši až po obeť (napr. D7 po operácii).
  3. Významný úbytok hmotnosti (> 15% hmotnosti) je klasicky zaznamenaný medzi ľudskými cieľovými ukazovateľmi. Dôležitým znakom utrpenia zvieraťa je aj „ohnutý chrbát“, pomalé pohyby, vyčerpanosť, abnormálna tvorba hlasu pri úrazoch a/alebo výrazné agresívne správanie. Ak sa vyskytne ktorýkoľvek z týchto znakov alebo ich kombinácia, monitorovanie zvieraťa sa zvýši do niekoľkých hodín od jeho výskytu. Ak sa pohoda zvieraťa zhorší alebo sa nezlepší do 48 hodín, má sa za to, že je dosiahnuté neúnosné utrpenie a je vykonaná eutanázia.
  4. V čase zvolenia obetujte anestetizované myši dekapitáciou a odoberte mozog na ďalšiu analýzu.
  5. Eutanázia (dekapitácia) po anestézii izofluránom (5%).

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

SAH cerebrálny vazospazmus
Ako uvádza El Amki a kol. 22 ukazuje bazilárnu artériu (BA), strednú cerebrálnu artériu (MCA) a prednú cerebrálnu artériu (ACA) CVS bola prítomná v SAH modeli dvojitou intracisternálnou injekciou krvi v ACA, MCA alebo BA z D3 na D10 po operácii. Stručne (obrázok 2A), po usmrtení a dekapitácii myší boli mozgy odobraté a postfixované v 4% paraformaldehyde (PFA) a potom zmrazené na -80 ° C predtým, ako boli krájané na 20 m priečne plátky pomocou kryostatu. Farbenie hematoxylínom a eozínom bolo použité pre BA (interaurálny e0,40 mm; Bregma -3,40 mm), MCA (interaurálny 2,58 mm; Bregma -1,22 mm) a ACA (interaurálny e4,90 mm; Bregma 1,10) mm) s cieľom umožniť identifikáciu CVS prostredníctvom systematického záznamu obrazu farebných tabúľ pomocou kamery s mikroskopom. Na vyhodnotenie neprítomnosti alebo prítomnosti makroskopického CVS sa pre každú zafarbenú artériu vypočítal pomer lúmenovej plochy k hrúbke steny. Čím nižší je pomer, tým je CVS ťažší. Napríklad CVS sa vyskytlo v BA v mozgu SAH v porovnaní s fingovanými myšami mozgu (obrázok 2B), ale aj v iných veľkých mozgových tepnách (MCA, ACA, údaje nie sú uvedené 22).

Diskusia

V tejto súvislosti je model podobný klinickej fyziopatológii SAH, pokiaľ ide o CVS spojenú s SAH. Všeobecne sa CVS vyskytuje po 1 hodine u potkanov 40 a po 3 dňoch u myší 17 v MCA a BA v modeli endovaskulárnej perforácie. Na prechiasmatickom modeli cisternovej injekcie krvi bola incidencia CVS u potkanov preukázaná medzi dvoma dňami 49 a 8 dňami 37. V modeli s dvojitou injekciou v cisterna magna u potkanov sa CVS vyvinul medzi 10 minútami 29 a 3 dňami 31. Ako prví popisujeme kinetický vzhľad CVS v myšom modeli SAH dvojitou injekciou, stanovujeme CVS v hlavných mozgových artériách (ACA, MCA a BA) po dobu 3 dní a pretrvávame do 10. dňa po SAH 22, blízko toho čo sa pozoruje u pacientov s SAH. Tento posledný model by sa dal definovať ako kvalifikovaný model SAH, dostatočne rigorózny bez mortality, aby umožnil štúdium mechanizmov a terapeutík zameraných na CVS.

Ďalším nekontrolovaným parametrom v modeli SAH boli možné variácie stredného arteriálneho krvného tlaku (MABP) vyvolané nadmerne rýchlou procedúrou injekcie krvi 27. V skutočnosti MABP zvyčajne akútne stúpa po experimentálnom SAH na udržanie cerebrálneho perfúzneho tlaku a potom klesá na východiskovú hodnotu. V modeli SAH sme injekčne podávali krv alebo aCSF (približne 10 l/min) nízkou rýchlosťou, aby sme sa vyhli týmto variáciám MABP. Pokiaľ ide o neurobiologické udalosti v tomto modeli, napodobňujúce tie, ktoré sa vyskytujú u ľudí, predtým sme preukázali, že model SAH s dvojitou injekciou krvi indukuje dlhotrvajúce CVS, mikrotrombózu a poškodenie mozgu poškodzujúce mozog vrátane defektnej paravaskulárnej difúzie od 3. do 10. dňa po videl 22. Avšak nedávne údaje popisujúce, že CSD je zapojený do DCI 13 spojeného s SAH, výrazne podporujú uskutočnenie tohto typu štúdie na modeli dvojitej injekcie myší. To by malo umožniť vedecké objavy o pozitívnych účinkoch nových terapií zameraných na CSD.

Na záver by som chcel povedať, že dvojitá injekcia celej arteriálnej krvi do modelu cisterny magna je zvládnutý model, ktorý poskytuje ľahký spôsob ako napodobniť ľudskú fyziopatológiu SAH vrátane CVS, mikrotrombózy, vaskulárneho zápalu, neurologických deficitov a úmrtnosti. Predstavuje validovaný model na testovanie nových terapeutických prístupov k liečbe chorobnej úmrtnosti spojenej s SAH.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.