Histologické techniky farbenia ako nástroje analýzy potravín. Možnosti a limity
1 workshop o histológii potravín/56. workshop o hygiene potravín GAP Histologické techniky farbenia ako nástroje kontroly potravín Možnosti a limity Kontaktná osoba: Alexandra Bartholomä Poradenstvo a hodnotenie Tel .: +49 (2151) Fax: +49 (2151) Úrad pre chemické a veterinárne vyšetrovania Rhein-Ruhr-Wupper AöR, Strana 1 Deutscher Ring 100, Krefeld Internet:
2 Rutinné postupy pre histologickú analýzu potravín Úradný odber vyšetrovacích postupov (ASU) podľa 35 LMBG L (december 1989). Stanovenie tkanivového zloženia mäsa, mäsových výrobkov a údenín. Rutinný postup pre kvalitatívne a kvantitatívne histologické vyšetrenie. Pojem: Pod tkanivovo podstatným zložením mäsových výrobkov. rozumel súčet spracovaných častí zabitých alebo zabitých teplokrvných zvierat. Do nálezov o podstatnej povahe možno zahrnúť aj identifikovateľné bunky rastlinného pôvodu. Strana 2
3 spôsoby farbenia podľa ASU L strana 3
4 Ďalšie spôsoby farbenia, strana 4
5 Farbenie Calleja Princíp: s plazmovým sfarbením picroindigo karmínom sú rôzne zložky tkaniva zafarbené odlišne; zafarbenie jadra sa robí nukleárnou rýchlou červenou Vyhodnotenie: Jadrá buniek: červenohnedé (ťažko dosiahnuteľné intenzívne zafarbenie jadra) Svaly zahrievané: svetlozelená, nevyhrievaná: silno zelená až tmavozelená veľký parenchým, iné tkanivá: (svetlý) zelený kolagénové spojivové tkanivo vyhrievané: bledomodré, nezahrievané: modré elastické spojivové tkanivo: žltá chrupavka, kosti: modrá strana 5
6 Farbenie Calleja-Lugol = kombinácia farbenia Calleja a Lugolovho farbenia Použitie vo výrobkoch obsahujúcich uhľohydráty (napr. Fašírky) Použitie vo vzorkách, ktoré sú makroskopicky pozitívne na Lugol Princíp: v Lugole sú navyše detekované sacharidy (najmä prírodný škrob). Jód obsiahnutý v roztoku je uložený v špirále špirály sacharidov a zobrazuje ich modrou a čiernou farbou, aby rozlíšil škrob a podobne štruktúrované uhľohydráty s 1,4-väzbou od iných uhľohydrátov. Liečba amylázou sa môže uskutočniť na paralelných rezoch pred farbením (0, 5% roztok amylázy vo fosfátovom tlmivom roztoku počas 2 hodín) (historicky: vzorka slín) ošetrenie amylázou slúži na overenie pevnosti paralelných rezov ošetrených amylázou obsahujúcich škrob, je možné posúdiť štruktúry predtým pokryté modro-čiernou hrúbkou strana 6
7 Farbenie Calleja (Lugol) Vyhodnotenie: orgány a tkanivá sú znázornené ako pri farbení Calleja. Sacharidy navyše - helixy sú sfarbené do hneda až čierna Výsledok po ošetrení amylázou: Škrob a podobne štruktúrované sacharidy so zlúčeninou -1,4 nie sú detekovateľné alebo nie sú zobrazené na strane 7
8 možností farbenia Calleja (Lugol): prehľad a diferenciálne farbenie! kvantitatívne hodnotenie prostredníctvom dodatočného vyšetrenia mnohých tkanív/orgánov (nie pečene!), možná identifikácia a (semi) kvantitatívne stanovenie množstiev: kostrových, srdcových a jazykových svalov (vrátane stupňa rozdrobenia) spojivového tkaniva (kolagénové/elastické spojivové tkanivo), kostného tkaniva, chrupavkového tkaniva, ciev, Žľazové tkanivo, lymfatické tkanivo, nervové tkanivo, kožná sliznica pečeň, obličky, pľúca a iné droby prepracované klobásové mäso s vnútorným aj bez obalu (možné falošne negatívne výsledky) rastlinné zložky (napr. Korenie, hľuzovky) ochrana klastrov rastlinných buniek polarizačným mikroskopom) strana 8
9 Farbenie Calleja (Lugol) Možnosti: Indikácia prítomnosti nemasových prísad Diferenciácia surového a zahriateho materiálu Detekcia škrobu a analógov uhľohydrátov s väzbou -1,4 (iba farbenie Calleja-Lugol) Indikácia prítomnosti uhľohydrátov v farbenie Calleja-Lugol, ak štruktúry zostanú zafarbené po ošetrení amylázou strana 9
10 Limity farbenia Calleja (Lugol) Limity: v závislosti od stupňa zahrievania sa bunkové jadrá niekedy nezobrazia optimálne. Sacharidy nie sú pri farbení Calleja zvýraznené. Pri farbení Calleja-Lugol je detekcia KH spojená s určitou štruktúrou molekuly KH. Strana 10
11 Calleja (Lugol) sfarbenie klobásy na jazyku 25x strana 11
12 Calleja (Lugol) sfarbenie klobásy na jazyku 100x strana 12
13 Calleja (Lugol) morenie varenej klobásy 25x strana 13
14 Calleja (Lugol) farbenie varenej klobásy 100x strana 14
15 Calleja (Lugol) sfarbenie varenej klobásy 25x strana 15
16 Calleja (Lugol) sfarbenie varenej klobásy 100x strana 16
17 Calleja (Lugol) sfarbenie surovej klobásy 25x strana 17
18 Calleja (Lugol) zafarbenie surovej klobásy 100x strana 18
19 Calleja (Lugol) farbenie varenej salámy 100x strana 19
20 Calleja (Lugol) farbenie varenej salámy 100x strana 20
21 Calleja (Lugol) sfarbenie červenej klobásy 25x strana 21
22 Calleja (Lugol) sfarbenie varenej klobásy 100x strana 22
23 Calleja (Lugol) sfarbenie varenej klobásy 100x strana 23
24 Calleja (Lugol) vyfarbujúca hydinová klobása 100x strana 24
25 Calleja (Lugol) sfarbenie pečeňovej klobásy 25x strana 25
26 Calleja (Lugol) sfarbenie varenej klobásy 25x strana 26
27 Calleja (Lugol) sfarbenie varenej klobásy 100x strana 27
28 Calleja (Lugol) sfarbenie varenej klobásy (Wiener) 100x strana 28
29 Calleja (Lugol) sfarbenie varenej klobásy (Wiener) 100x strana 29
30 Farbenie na hematoxylín-eozín (HE) Prehľad farbenia sa často označuje ako farbenie na hemalum-eozín. Princíp: Orgánové štruktúry je možné rozlíšiť farbením bunkových jadier hematoxylínom a cytoplazmu eozínom. Vyhodnotenie: Jadrá buniek: modrofialová
31 Farbenie na hematoxylín-eozín (HE) Možnosti: Podozrivé nálezy dosiahnuté pri farbení Calleja (napr. Prítomnosť srdca, pečene, obličiek, pľúc, kožnej sliznice, kože hydiny, kože) možno overiť, pretože kontrastujú bunkové jadrá a cytoplazma. Limity: v porovnaní Pri farbení Calleja je ťažšie odlíšiť a kvantifikovať spojivové tkanivo a svaly kvôli nedostatku farebných kontrastov Sacharidy nie sú zvýraznené Rutinné použitie súbežne s farbením Calleja nie je potrebné strana 31
32 Haematoxylin-eosin (HE) zafarbenie pečeňovej klobásy 100x strana 32
33 Impregnácia dusičnanom strieborným podľa Kossaho diferenciálneho zafarbenia na detekciu kostného tkaniva Princíp: viazaný vápnik v uhličitanoch a fosforečnanoch sa vymieňa za ióny striebra pridaním pyrogallolu a manganistanu draselného, zlúčenina striebra sa redukuje na kovové striebro, významné koncentrácie vápnika sa viažu iba v kostiach, akékoľvek iné Rozpustné ióny vápnika sa vymyjú počas predbežnej úpravy rezov Vyhodnotenie: Kostné častice: čierne Cytoplazma: červeno-hnedá Jadrá buniek: červená strana 33
34 Impregnácia dusičnanom strieborným podľa varenej klobásy Kossa 100x strana 34
35 Trichrómové farbenie podľa Pfeiffera, Wellhäusera a Gehru - Alizarínové farbenie S Diferenciálne farbenie na kvalitatívnu a kvantitatívnu detekciu mineralizovaných častíc kostí Princíp: Mineralizovaná kosť znamená kostný materiál obsahujúci vápnik (hydroxyapatit) s pH 4,3-4,5. vápnik kosti (a tiež ďalšie dvojmocné katióny (Mg, Al)) a alizarín S ochrana jasne žlto-červenej chelátovej zlúčeniny (farebný lak) (nie je popísaná v ASU): dodatočné zafarbenie časti predtým odvápnenej 5% kyselinou dusičnou z rovnakého materiálu V odvápnenej časti so zachovanou morfológiou častice kosti nadobúdajú modrú farbu zvyšku tkaniva, pretože vápnik bol rozpustený. Počítanie kostných častíc (nie je popísané v ASU): Kvantitatívne počítanie sa skúma 10 rezov alebo približne 40 cm² (Bijker a kol., 1984). ) Strana 35
36 Trichrómové farbenie podľa Pfeiffera, Wellhäusera a Gehru - Alizarin S farbenie Hodnotenie: Kosti: červené Chrupavka: modré Svaly a spojivové tkanivo: modré Výsledok po ošetrení kyselinou dusičnou: Svaly, spojivové tkanivo, demineralizované kosti: modrá Jaskyňa: Odstránenie kostných častíc počas prípravy prípravkov, napr. Pri rezaní je možné z rezu vytlačiť veľmi veľké kostné častice, v reze zostáva viditeľná medzera Demineralizácia kostných častíc (napr. Dlhším skladovaním formalínu) Obsah kostí preto nemožno preceňovať, skôr podceňovať strana 36
37 Trichrómové farbenie podľa Pfeiffera, Wellhäusera a Gehru - farbenie hydinovej klobásy Alizarin S 25x strana 37
38 Trichrómové farbenie podľa Pfeiffera, Wellhäusera a Gehru - farbenie hydinovej klobásy Alizarin S 100x strana 38
39 Trichrómové zafarbenie podľa Charvatovho diferenciálneho zafarbenia na detekciu prepracovanej obarenej klobásy Princíp: farba identifikuje častice dymu (v obale a klobása dole). Farba zobrazuje povrch klobásy zmenený po údení a na ňu priamo naviazané tkanivo Hodnotenie: hrany údených častí klobásy: oranžovo-červená Zvyšné časti prípravku: sivozelené častice prepracovanej klobásy sú kvôli dvojitému ohrevu zvyčajne zhutnené a nie sú úplne integrované do klobásového mäsa, čím viac je spracovaný materiál nastrúhaný, tým ťažšie sa dá zistiť strana 39
40 Trichrómové zafarbenie podľa Charvata Možnosti: V závislosti na intenzite fajčenia je uvedená μm široká oranžovo-červená vrstva. Fajčenie je možné vykonať aj po odstránení obalu (olúpanú pokožku). Limity: Nie je možné zobraziť nefajčenú prírodnú pokožku (varené klobásy, kari klobásy). Vďaka svojej väčšej hrúbke a existujúcim inklúziám v Grocottovom zafarbení (čierne) alebo v polarizácii prechádzajúcim svetlom (spektrálne farby) možno znovu spracované častice varenej klobásy rozpoznať aj v farbe Calleja alebo Calleja-Lugol vďaka zhutnenej štruktúre a intenzívnejšej zelenej farbe! 40
41 Trichrómové sfarbenie podľa varenej klobásy Charvat 100x strana 41
42 Trichrómové sfarbenie podľa varenej klobásy Charvat 200x strana 42
43 Calleja Lugol morenie varenej klobásy 25x strana 43
44 Grokottovo farbenie Diferenciálne farbenie Impregnácia striebrom sa používa na detekciu uhľohydrátov s 1,2 diolovými skupinami, napr. V zahusťovadlách, rastlinných bielkovinových prípravkoch a prírodných črevách obsahujú rastlinné bielkovinové prípravky zvyšky zložiek bunkovej steny (uhľohydráty), ktoré sú vďaka Grokottovmu sfarbeniu viditeľné ako inklúzie v proteínových časticiach. Princíp: pri impregnácii striebrom podľa Grokotta sú polysacharidy detekované dvoma hydroxylovými skupinami na susedných atómoch uhlíka. (1,2-diolové skupiny) tieto prichádzajú napr. v škrobu, guarovej múke, karobovej múke, agare, algináte, xantáne a derivátoch celulózy pred hydroxylovými skupinami sa oxidujú na aldehydy kyselinou chrómovou, tieto aldehydové skupiny redukujú dusičnan strieborný a sú zobrazené hnedočierne a potom tónované chloridom zlatým strana 44
45 Špeciálne škvrny: Grokottovo farbenie Vyhodnotenie: Sacharidy (KH): čierne Svaly: ružové Spojivové tkanivo: ružové Rastlinné bielkoviny: ružové, ak sú zistené rastlinné, tj. Častice bielkovín obsahujúce uhľohydrát, čierno sfarbené uhľohydráty sú uložené v ružových bielkovinových časticiach, čím sú rastlinné bielkoviny čistejšie, čím menej je prítomných uhľohydrátov a je detegovateľné ošetrenie amylázou na odlíšenie škrobu a podobne štruktúrovaných uhľohydrátov s - 1,4-väzbou iných uhľohydrátov, ošetrenie amylázou je možné vykonať na paralelných rezoch pred farbením Výsledok po ošetrení amylázou škrob a podobne štruktúrované uhľohydráty s α-1,4 odkaz 45 nie je zistiteľný
46 Grokottovo farbenie Možnosti: Detekcia rastlinných múčok a bielkovinových prípravkov bohatých na bielkoviny Rastlinné bielkovinové prípravky: sója, bavlník, vlčie bôby, repka olejná, slnečnica, pšenica, kukurica, šošovica, fazuľa Morfologické kritériá: Múky: Palisády a hodinové sklenené bunky sójovej múky Bielkovinové prípravky: napr. TVP - hubovitá štruktúra pšeničného lepku, ringletový typ sójového proteínu Limity: hydrolyzáty, ktoré nie sú zistiteľné, druh rastlinného proteínu nemožno určiť, morfológia poskytuje informácie na pôvodnej strane 46
47 Farebná varená klobása Grokott (Wiener) 200x strana 47
48 Bauer-Calleja-F./Loď s kyselinou periodickou Reganz-F. (PAS) diferenciálne zafarbenie Obidve zafarbenia slúžia na detekciu uhľohydrátov s 1,2 diolovými skupinami v prípravkoch rastlinného proteínu TVP, ktoré obsahujú zvyšky zložiek bunkovej steny (uhľohydráty), ktoré sú viditeľné ako inklúzie v proteínových časticiach. Bauerovo-Callejovo farbenie sa vykonáva podľa ASU oxidáciou kyselinou chromovou.: farbivo sa viaže na 2 susedné voľné aldehydové skupiny, na oxidáciu sa môže použiť menej agresívna kyselina jodistá (= PAS sfarbenie) Princíp: detegujú sa polysacharidy, v ktorých sú na bezprostredne susediacich atómoch uhlíka dve hydroxylové skupiny (1,2 diolové skupiny) poď napr. v škrobu sa guarová múka, karobová múka, agar, alginát, xantán a deriváty celulózy pred hydroxylovými skupinami oxidujú na aldehydy kyselinou chrómovou (farbivo Bauer-Calleja) alebo kyselinou jodistou (PAS) strana 48
49 Bauer-Calleja-F./Loď s kyselinou periodickou Reganz-F. (PAS) Hodnotenie: Sacharidy: červenofialové svaly: zelené elastické spojivové tkanivo: žltý kolagén. Spojivové tkanivo, chrupavka, kosti: bledomodrý rastlinný proteín: ošetrenie zelenou amylázou na odlíšenie škrobu a podobne štruktúrovaných uhľohydrátov s - 1,4-väzbou od iných uhľohydrátov, ošetrenie amylázou je možné vykonať na paralelných rezoch pred farbením. Výsledok po ošetrení amylázou škrob a analogicky štruktúrované uhľohydráty α -1,4-väzba je nedetekovateľná Možnosti a limity: ako pri farebnej stránke Grokott 49
Loď s kyselinou periodickou 50 s Reganz-F. (PAS) varená klobása (poľská Viedeň) 200x strana 50
51 Závery Stanovenie tkanivového zloženia mäsových výrobkov a údenín sa v posledných rokoch opäť dostalo na význam. Nemôže byť nahradené modernými analytickými metódami, pretože v mnohých otázkach je ako metóda priamej detekcie nevyhnutná pri určovaní zložiek dôležitých z hľadiska kvality, ako aj zakázaných a deklarovateľných. umožňuje diferenciáciu, identifikáciu a kvantifikáciu použitých prísad a poskytuje informácie o výrobnej technológii. Odchýlky od všeobecného vnímania širokej verejnosti môžu byť výsledkom použitia neobvyklých tkanív, zvýšeného stupňa drvenia alebo množstva uvoľneného svalového proteínu alebo pridania prepracovaného mäsa strana 51
52 Závery Prídavky nemasových prísad, ako sú rastlinné bielkovinové prípravky, zahusťovadlá, vysokomolekulárne hydrolyzáty spojivového tkaniva alebo rastlinné vlákna, ktoré vyvolávajú požiadavku na deklaráciu alebo nie sú povolené v závislosti od produktu, sa zisťujú pomocou špeciálnych farieb. Na hodnotenie farebných prípravkov sa spravidla používa mikroskopické hodnotenie prípravkov Calleja alebo Calleja-Lugol. Obchodovateľnosť dostatočná! Strana 52
53 Ďakujem za pozornosť! Kontaktná osoba: Alexandra Bartholomä Poradenstvo a hodnotenie Tel .: +49 (2151) Fax: +49 (2151) Úrad pre chemické a veterinárne vyšetrovania Rhein-Ruhr-Wupper AöR, strana 53 Deutscher Ring 100, Krefeld Internet: