Identifikácia metabolicky aktívnych baktérií v čreve generála Spodoptera littoralis

Zhrnutie

Aktívne bakteriálne spoločenstvo spojené s črevom Spodoptera littoralis sa stanovilo stabilným sondovaním izotopov (SIP) spojeným s pyrosekvenovaním. Touto metódou sa identifikácia metabolicky aktívnych bakteriálnych druhov v spoločenstve uskutočňovala s vysokým rozlíšením a presnosťou.

Abstrakt

Vnútornosti väčšiny hmyzu nie sú patogénne obývané zložitými spoločenstvami symbiotických baktérií. V rámci týchto mikrobiálnych spoločenstiev je možné nájsť alebo identifikovať mutualistické bakteriálne druhy. Bolo pozorované, že tieto látky slúžia hmyzu viacerým funkciám, čo pomáha pri reprodukcii hmyzu, podporuje imunitnú odpoveď 2, produkciu feromónov 3, ako aj výživu vrátane syntézy esenciálnych aminokyselín 4, okrem iného.

Z dôvodu dôležitosti týchto združení sa vyvinulo veľké úsilie s cieľom charakterizovať spoločenstvá až po jednotlivých členov. Väčšina z týchto snáh bola založená buď na kultivačných metódach, alebo na generovaní fragmentov génu 16S rRNA, ktoré boli pre konečnú identifikáciu sekvenované. Tieto prístupy sú bohužiaľ známe iba v prípade druhov intestinálnych baktérií a neposkytujú žiadne informácie o metabolickej aktivite mikroorganizmov.

Na charakterizáciu metabolicky aktívnych bakteriálnych druhov v čreve hmyzu sme použili stabilné izotopové sondovanie (SIP) in vivo s použitím 13C-glukózy ako univerzálneho substrátu. Toto je sľubná technika bez kultúry, ktorá umožňuje prepojenie mikrobiálnych rodokmeňov s ich konkrétnou metabolickou aktivitou. To je možné sledovaním stabilných izotopom označených atómov zo substrátov v mikrobiálnych biomarkeroch, ako sú DNA a RNA 5. Inkorporácia 13 C izotopov do DNA zvyšuje hustotu označenej DNA v porovnaní s neznačenou (12 C). Na konci sa 13C-značená DNA alebo RNA oddelí od 12C-neoznačeného podobného 6 ultracentrifugáciou s gradientom hustoty. Následná molekulárna analýza separovaných izotopológov nukleových kyselín vytvára spojenie medzi metabolickou aktivitou a identitou druhu.

Tu uvádzame protokol používaný na charakterizáciu metabolicky aktívnych baktérií v čreve generála hmyzu (náš modelový systém), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Fylogenetická analýza DNA sa uskutočňovala pomocou pyrosekvenovania, ktoré umožňuje vysoké rozlíšenie a presnosť pri identifikácii bakteriálnych spoločenstiev intestinálneho hmyzu. Ako hlavný substrát sa v experimentoch použila glukóza značená13C. Substrát bol hmyzu kŕmený umelou stravou.

Úvod

S príchodom technológií sekvenovania založených na PCR sa zvyšuje počet štúdií využívajúcich črevnú biotu z viacerých organizmov (t. J. Ľudí, hmyzu alebo morských organizmov). Okrem toho sú výsledky izolácie a kultivácie baktérií prenášajúcich črevo nezávislé ako v minulosti. Takmer 99% baktérií nie je možné kultivovať a je ťažké simulovať podmienky prostredia v čreve sekvencované, amplifikované, klonované. Pomocou týchto informácií môže užívateľ identifikovať bakteriálny druh po zhromaždení informácií o sekvenciách z verejných databáz 13, 14. Sekvenovanie sa však blíži k nedostatočnému popisu bakteriálnych spoločenstiev z dôvodu nedostatku informácií o metabolickom prínose každého druhu v spoločenstve.

Tu používame 13C-glukózu na „označenie“ DNA metabolicky aktívnych bakteriálnych druhov v čreve. Glukóza je cukor používaný väčšinou bakteriálnych druhov pozdĺž rozšírenej cesty Entner-Doudoroff (ED), aj keď sú známe výnimky 20. To oprávňuje použitie 13C-glukózy ako spoľahlivej metabolickej sondy, ktorá spája príslušné metabolity a Zdroj uhlíka pozdĺž zavedených dráh. V závislosti na vedeckej otázke sa na riešenie metabolických aktivít môžu použiť iné substráty, tj. 13 C-metán, 13 CO 2 alebo rastliny pestované v atmosfére 13 CO 2.

Na tomto mieste uvádzame protokol používaný pri metabolickej charakterizácii bakteriálnej komunity v čreve generála hmyzu, konkrétne S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Okrem toho bola metóda spojená s pyrosekvenovaním, čo zase umožňuje identifikáciu črevných bakteriálnych spoločenstiev hmyzu s vysokým rozlíšením a presnosťou. Ako hlavný substrát sa v experimentoch použila glukóza značená13C.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

  1. Kúpte si alebo získajte vajcia spojok Spodoptera littoralis z vlastného chovu. Udržujte ich v sterilných Petriho miskách pri izbovej teplote (RT) až do vyliahnutia.
  2. Pripravte si umelé kŕmenie pre chov hmyzu nasledovne:
    1. 500 g mletej bielej fazule namočte na noc do 100 ml vody.
    2. Do 1 000 ml destilovanej H20 sa pridá 9,0 g kyseliny askorbovej a 75 g agaru a potom sa varí.
    3. Zmes sa nechá vychladnúť a keď stuhne (do bielej voskovitej pevnej zmesi), uskladní sa pri teplote 4 ° C do použitia.
  3. Premiestnite novo vyliahnuté larvy do čistej plastovej nádoby a vložte ich do systému umelého kŕmenia pri teplote 23 - 25 ° C počas dlhého dňa so 16 hodinovým režimom osvetlenia a 8 hodín tmy. Jedlo každý deň obmieňajte, kým larvy neprejdú všetkými šiestimi larválnymi štádiami.

2. 13 C značenie DNA v metabolicky aktívnych črevných baktériách

  1. Rozpustite 186,1 mg glukózy značenej úplne 13 C v destilovanej a deionizovanej vode (ddH20) a dobre premiešajte so 100 g umelej potravy pre experiment SIP. Zaistite konečnú koncentráciu 13 C-glukózy 10 mM v umelom kŕmení. Toto napodobňuje in situ koncentráciu glukózy v čreve lariev S. littoralis na rastlinách bavlníka podľa Shao et al. (odovzdané).
  2. Asi 9-15 zdravých druhých lariev instaru od chovného boxu po sterilné plastové Petriho misky (jedna larva na Petriho misku) s čerstvou 13 C-glukózou zmiešanou s umelou výživou. Umelá výživa s rovnakým množstvom natívnej glukózy (12 C-glukózy), ako je opísané pre kŕmenie kontrolnej skupiny.
  3. Počas inkubačnej doby (1 deň) často obnovujte umelé kŕmenie. Použite podmienky chovu ako v kroku 1.3.
  4. Z každého ošetrenia sa zhromaždí deväť lariev na ďalšie spracovanie (extrakcia DNA). Každý replikát sa skladá z troch ľudí, pričom sa každé ošetrenie opakuje najmenej trikrát.

4. Extrakcia a amplifikácia DNA

6. Charakterizácia DNA pyrosekvenovaním

7. Analýza údajov pyrosekvenovaním

  1. Analyzujte segmenty surovej sekvencie generované pyrosekvenovaním 454 pomocou softvérového potrubia QIIME „Quantitative Insights into Microbial Ecology“. Postupujte takto:
    1. Najskôr pomocou 454 konvertujte 454 strojovo generovaný súbor sff na súbory FASTA, QUAL a Flowgram process_sff.py scenár.
    2. Potvrďte mapovací súbor (na základe check_id_map.py) a priradiť čítanie multiplexu biologickým semenám pomocou split_libraries.py Scenár. Vystrihnite konce s nízkou kvalitou s veľkosťou posuvného okna 50 a medznou hranicou priemernej kvality 25, dokonca eliminujte nejednoznačné krátke sekvencie (dĺžka je požadovaná. Predplatné odporúčajte svojmu knihovníkovi.

    Reprezentatívne výsledky

    Po ultracentrifugácii, akonáhle sa potvrdí množstvo DNA oddelenej v každej frakcii, a vykoná sa meranie hustoty, vynesie sa priemerná hustota frakcie v g/ml na počet frakcií, aby sa určila správna tvorba svahu v skúmavkách, ktorá zvyčajne zahrnuje rozsah potvrdzovacej hustoty. od 1 690 (pre frakciu 12 alebo 11) do 1 760 g/ml g/ml (pre frakciu 1). Kvantitatívne pyrosekvenovanie sa uskutočňuje priamo na reprezentatívnom gradiente SIP, aby sa odhalili líniové druhy a relatívna početnosť (Obrázok 2 ). Tu sme sekvenovali ťažké frakcie ako z 13 C-glukózy modifikovanej vzorky, tak z neoznačenej kontroly, ktorá slúžila na profilovanie aktívnych populácií v komunite. Po sekvenovaní bolo vygenerovaných celkovo 120 045 vysoko kvalitných čítaní s priemernou dĺžkou 404 nukleotidov. Profil pyrosekvenovania ukázal zvýšenú frekvenciu určitých druhov vrátane Enterococcus a Pantoea v označenej vzorke (DNA označená 13 C, 3) v porovnaní s kontrolnou skupinou (12 C kontrolná DNA, Obrázok 3). Preto by sa baktérie mali považovať za metabolicky aktívne a mali by si zaslúžiť ďalšie štúdium.

    čreve
    1. 13 Experiment s prísunom C-glukózy, extrakcia DNA a amplifikácia génu 16S rRNA pomocou PCR E. (A) 13C-glukóza modifikované umelé kŕmenie konzumované larvami Spodoptera littoralis. (B) Domorodci Glukóza (12C-glukóza) sa zmenila na umelé kŕmenie lariev z tej istej dávky hmyzu (A) použitý, ktorý slúži ako spotrebovaná kontrola . (C) Typický extrakt metagenómovej DNA z črevného tkaniva lariev v skupine liečenej13C-glukózou a 12 v kontrolnej skupine s C-glukózou. V každej skupine sú zahrnuté tri biologické replikáty (dráhy 1, 2 a 3). M znamená 1 kb DNA marker. (D) PCR amplifikácia so sadou univerzálnych bakteriálnych primérov generuje správne 1,5 kb 16S rRNA génové produkty pomocou extrahovanej metagenomickej DNA ako templátu. Dráha 1 je PCR pozitívna kontrola. Dráhy 2 a 3 nastavili vzorku ošetrenú 13 C-glukózou a 12C-kontrolu cukru. jpg "target =" _blank "> Kliknutím zväčšíte zobrazenie.

    metabolicky
    2. Návrh experimentu Pyro-SIP s ultracentrifugáciou gradientu hustoty CsCl a frakciou s pyrosekvenčnou charakterizáciou separovanej DNA. H = vyššia početnosť, L = menšia početnosť a početnosť. Kliknite sem pre väčšie zobrazenie .

    aktívnych
    3. Bakteriálna diverzita a relatívny výskyt v ťažkých frakciách natívnych lariev vyživovaných glukózou (12 C-kontrolná DNA) a 13 C-glukózy vyživovaných lariev (DNA označená 13 C)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Kliknite tu pre zväčšenie.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Diskusia

    Spoločne tu opísaný protokol poskytuje jednoduchú, rýchlu a efektívnu metódu na stanovenie metabolických aktivít črevnej flóry, ktorú je možné ďalej použiť na hodnotenie špecifickej úlohy bakenriálnych symbiontov vo výžive, detoxikácii a obrane hostiteľa.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.