Identifikácia miest transkripčného faktora Olig2 pre genové väzby v akútne purifikovanom PDGFR; Bunky podľa
Zhrnutie
Tu uvádzame protokol navrhnutý na analýzu väzby transkripčného faktora oligodendrocytu 2 (Olig2) v celom genóme v akútne vyčistených mozgových oligodendrocytových progenitorových bunkách (OPC) uskutočňovaním nízkobunkovej imunoprecipitácie chromatínu (ChIP), prípravy knižnice, vysoko výkonného sekvenovania a bioinformatická analýza údajov.
Abstrakt
Úvod
Je dôležité študovať väzbu DNA na proteín (alebo proteínový komplex) a epigenetické markery, aby sa vytvorili transkripčné regulačné siete v rôznych biologických procesoch. Najmä väzby medzi transkripčnými faktormi a genómovou DNA môžu hrať dôležitú úlohu v regulácii génov, diferenciácii buniek a vývoji tkanív. Je to mocný nástroj na štúdium transkripčnej regulácie a epigenetických mechanizmov imunoprecipitácie chromatínu (ChIP). Vďaka rýchlemu pokroku v technológii sekvenovania novej generácie sa používa analýza väzby proteín-DNA a epigenetické značenie v 1 ChIP spárovanom s vysokovýkonným sekvenovaním DNA (ChIP-Seq). Avšak štandardný protokol ChIP-Seq vyžaduje približne 20 miliónov buniek na reakciu, čo sťažuje použitie tejto techniky, keď je bunka obmedzená, ako sú izolované primárne bunky a zriedkavé bunkové populácie.
Bunky radu oligodendrocytov vrátane buniek progenitorových oligodendrocytov (OPC) a oligodendrocytov sú rozšírené v celom mozgu a sú nevyhnutné pre vývoj a funkciu mozgu. Ako typ progenitorovej bunky sa OPC môžu samy obnovovať a rozlišovať. OPC slúžia nielen ako progenitory oligodendrocytov, ale tiež hrajú dôležitú úlohu pri šírení nervovej signalizácie prostredníctvom komunikácie s inými typmi mozgových buniek 2. Predchádzajúce štúdie naznačujú, že pohlavne špecifické transkripčné faktory, ako sú Olig2 a Sox10 3, 4, regulujú vývoj oligodendrocytov. Tieto transkripčné faktory boli lokalizované v organizátorových alebo zosilňovacích oblastiach, aby viazali niektoré rozhodujúce gény na ich expresiu, pričom ovplyvňovali špecifikáciu a diferenciáciu oligodendrocytov. Je však ťažké určiť záujem o proteín viažuci DNA (alebo proteínový komplex) o akútne purifikované primárne OPC s veľmi obmedzeným počtom buniek.
Tento protokol popisuje, ako systematicky skúmať genómovú DNA imunoprecipitovanú Olig2 v purifikovaných myších OPC na úrovni celého genómu pomocou techniky ChIP-Seq. OPC myšacieho mozgu boli akútne purifikované imunopanzovaním a v experimente ChIP bez diseminácie in vitro. Obmedzený počet OPC sa dá získať imunopanzovaním a je dostatočný pre štandardné experimenty s ChIP-Seq. Toto popisuje nízko bunkový protokol ChIP-Seq s tak nízkym počtom buniek ako 20 000 na jednu ChIP reakciu pre transkripčné faktory. Stručne povedané, zosieťované bunky boli lyžované a sonikované ultrazvukovým prístrojom, ktorý strihal chromatín. Strihaný chromatín bol inkubovaný s protilátkou Olig2 a guľkami potiahnutými proteínom A, aby sa vyzrážala genómová DNA viazaná na protilátku Olig2. Po elúcii guľôčok potiahnutých proteínom A a reverznom zosieťovaní sa genómová DNA vyzrážala protilátkami Olig2 a prečistila extrakciou fenol-chloroformom. Výsledný produkt sa kvantifikoval a podrobil sa T-chvostu, prepínaniu a rozširovaniu šablón žiarivej šablóny, pridaniu adaptérov a výstuží, výberu veľkosti knižnice a čistiacim krokom pre konštrukciu knižnice ChIP-Seq.
Po sekvenovaní sa kvalita surového materiálu načítala zo vzorky pripravenej pomocou protilátok proti transkripčnému faktoru Olig2 a analyzovala sa kontrolná vzorka. Dolné páry párov a adaptéry s fragmentmi čítania, ktoré boli orezané. Ďalej boli orezané čítania zarovnané s referenčným genómom myši. Genómové oblasti, ktoré boli významne obohatené na čítanie ChIP, boli rozpoznané ako vrcholy v porovnaní s kontrolnou vzorkou. Významné píky predstavujúce možné miesta viažuce transkripčný faktor sa filtrovali a vizualizovali v prehliadači genómu.
Metóda opísaná v tomto protokole môže byť hlavne používaná pre ChIP-Seq z iných transkripčných faktorov s akýmkoľvek typom bunky s obmedzeným počtom.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Protokol
Všetka spotreba zvierat a experimentálne protokoly sa uskutočňovali podľa Príručky pre starostlivosť a použitie laboratórnych zvierat a schválili ju Inštitucionálny výbor pre biologickú bezpečnosť a Výbor pre dobré životné podmienky zvierat na University of Texas Health Science Center v Houstone.
1. Čistenie PDGFRa pozitívnych oligodendrocytových líniových buniek z myšieho mozgu (upravené z predtým opísaných protokolov imunopanovania 5, 6, 7)
(2) Príprava Low-Cell-ChIP a konštrukcia knižnice ChIP pre vysoko výkonné sekvenovanie
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
Po počiatočnom vyhodnotení kontroly kvality sú grafmi kontroly kvality na obrázku 4 nespracované čítanie a orezávanie adaptérov a koncové páry párov báz nižšie.zobrazené. Orezané čítania by mali mať základnú kvalitu vyššiu ako 30, bez sekvencií adaptéra a mali by mať nízku duplikáciu (obrázok 4b-D.). Kvalitne upravené čítania zvyšujú celkovú mieru zarovnania. Ostatné parametre, ako je obsah GC, sú tiež dôležité a mali by sa brať do úvahy pri orezávaní.
Pri použití spárovaných koncových dát ChIP-Seq sa fragmenty viažu okolo transkripčného faktora s určitou vzdialenosťou separácie. Sekvenovanie párovaných koncov umožňuje presnejší odhad priemernej dĺžky fragmentu, čím sa získa lepší odhad genomických oblastí, v ktorých došlo k väčšej väzbe. Korelačný graf vlákien ukazuje špičkovú hodnotu obohatenia, ktorá zodpovedá prevažnej dĺžke fragmentu. Ako na obrázku 5nájdená, vypočítaná dĺžka fragmentu je 130 bp, zatiaľ čo čítanie trvá 50 bp. Súbor údajov ChIP-Seq, kde je dĺžka fragmentu dlhšia ako čítanie, naznačuje vysokú kvalitu 16 .
V Silico sú komplementárnymi metódami k experimentu ChIP-Seq analýza obohatenia motívu a hľadanie motívu de novo. Pretože väzba Olig2 v OPC nebola predtým skúmaná, na identifikáciu motívu de novo 4, 24 sa použili vrcholné motoneurónové progenitorové bunky odvodené z Olig2 ChIP-Seq a embryonálne kmeňové bunky. Identifikované motívy OLIG2 de Novo boli pridané do komplexnej databázy motívov ENCODE 25 a bola vykonaná analýza obohatenia motívov. Vysoké obohatenie de novo identifikovaných motívov OLIG2 a motívov známych transkripčných faktorov (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 a ASCL1) sa našlo na vrcholoch ChIP-Seq PDGFRa purifikovaných buniek. Obohatenie 30 de novo identifikuje motívy s hodnotou E, obrázok 7 ukazuje prvé dva de novo identifikované motívy Olig2. Tieto dva de novo identifikované motívy Olig2 sa našli okrem známych motívov v> 60% purifikovaných bunkách PDGFRa získaných z vrcholov ChIP-Seq.
Diskusia
Po zosieťovaní purifikovaných OPC by sa zosieťované bunky mali premyť ľadovo studeným roztokom HBSS a zvyšné kroky ChIP by sa mali vykonať pri 4 ° C, inak protilátka nemôže správne vyzrážať genomickú DNA.
Ďalším dôležitým krokom v tomto protokole je príprava knižnice. Na konštrukciu knižnice sa použila PCR amplifikácia materiálu ChIP. Počet cyklov PCR na prípravu knižnice závisí od množstva DNA. Kvalitná príprava knižnice vyžaduje presnú kvantifikáciu množstva prijatej DNA. Príliš veľa alebo príliš málo cyklov PCR môže ovplyvniť koncentráciu knižnice, ako aj zložitosť vedúcu k artefaktom PCR.
Je ťažké zostaviť knižnicu ChIP-Seq, keď máte obmedzený počet buniek na použitie pre imunoprecipitáciu 27. Štandardný doteraz používaný protokol ChIP vyžaduje 10 ng prípravy imunoprecipitovanej DNA-ChIP-Seq knižnice 1, 28. Avšak tu opísaný protokol normálne generuje 2 ng imunoprecipitovanej DNA protilátkami Olig2 z 20 000 OPC. DNA sa používa na prípravu knižnice ChIP-Seq pomocou jednostupňovej adaptérovej metódy, ktorá umožňuje vylepšenú citlivosť umožňujúcu amplifikáciu pikogramov imunoprecipitovanej DNA. Tento protokol kombinujúci komerčné súpravy ponúka praktické riešenie vykonávania ChIP-Seq pre transkripčné faktory založené na malom počte buniek.
Dôležité je, že popísaný nízko bunkový protokol ChIP-Seq je použiteľný aj pre ChIP-Seq z iných transkripčných faktorov v primárnych bunkách alebo vo vzácnych bunkových populáciách. Protilátky použité v tomto protokole musia byť experimentálne overené, aby sa najskôr uskutočnil konkrétny IP experiment. Nešpecifická väzba protilátok vedie k zlým výsledkom. Okrem toho sa odporúča uskutočniť tento nízko bunkový experiment ChIP-Seq v bunkách s vysokou expresiou sledovaného transkripčného faktora.
Pre analýzu údajov môže byť ťažké rozhodnúť, ktoré hodnoty sa majú použiť ako medzné hodnoty po vyvolaní filtrovania špičiek. V závislosti od cieľa analýzy je možné použiť prísnejšie alebo uvoľnenejšie parametre. Typicky sa používa kombinácia obohatenia kompartmentu a p-hodnoty alebo FDR. Ak boli predtým študované niektoré miesta viažuce transkripčný faktor, mohlo by to pomôcť pri určovaní prahov filtrovania. Boli zostavené databázy webových stránok viažucich transkripčný faktor z verejne dostupných experimentov ChIP-Seq v rôznych bunkových líniách a podmienkach 29, 30. Dalo by sa vyhľadať gén a skontrolovať, či sa predtým našli väzbové miesta pre transkripčný faktor. Je však dôležité vedieť, že väzbové miesta pre transkripčný faktor sa líšia v závislosti od typov buniek a podmienok.
V Silico sú ďalšími metódami k ChIP-Seq-experimentu analýza obohatenia motívu a de novo motívové vyhľadávanie pomocou MEME-ChIP 20 alebo podobných programov. Hľadanie motívov vyžaduje komplexnú známu a de novo odvodenú databázu motívov z. B. Motívy ENCODE 25 alebo databáza Hocomoco 31. Hocomoco je databáza s motívmi objavenými z verejne prístupných ľudských a myších experimentov ChIP-Seq. Ak nie sú známe motívy pre predpokladaný proteín, hľadanie motívov de novo by mohlo odhaliť opakujúce sa sekvenčné vzory vo významnej časti vrcholov ako nové motívy. Kombinatorické možnosti pôsobenia transkripčných faktorov je možné predstaviť, ak sa nájdu aj motívy z iných transkripčných faktorov obohatené o výsledné vrcholy.
Obohatené oblasti píku je možné experimentálne overiť použitím chromatínu mutovaných alebo knockoutovaných buniek ako kontroly. Uskutočnenie ChIP-Seq s bunkami, ktoré neexprimujú transkripčný faktor, sa používa na identifikáciu falošne pozitívnych vrcholov, tiež označovaných ako „fantómové vrcholy“ 32. Falošne pozitívne výsledky sa odfiltrujú.
Je tiež zaujímavé porovnať výsledné vrcholy ChIP-Seq s transkriptomickými dátami. Píky PDGFRa-Olig2 ChIP-Seq sa porovnali s expresiou génov v OPC z predchádzajúcej publikácie 18. Táto stratégia môže byť obmedzená, pretože je možné riadiť mechanizmy viažuce exprimované gény v OPC ako transkripčný faktor Olig2. Okrem toho môže transkripčný faktor Olig2 viazať regulačnú oblasť génu, ale gén môže mať nízku hladinu génovej expresie kvôli možným inhibičným mechanizmom alebo nedostatku kofaktorov potrebných na génovú transkripciu.
ChIP-Seq je metóda používaná na identifikáciu väzbových miest pre DNA v celom genóme pre transkripčné faktory a ďalšie proteíny. Avšak analýzou súčasného výskytu transkripčných faktorov vedci zistili, že transkripčné faktory majú tendenciu asociovať sa s inými proteínmi tvoriacimi Co modul 33. To znamená, že niektoré spojenia medzi transkripčnými faktormi a genómovou DNA odhalené pomocou ChIP-Seq sú nepriame a premostené inými proteínmi. Preto, aby výskumníci získali zmysluplnejšie výsledky, mali by študovať viac transkripčných faktorov súčasne.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Zverejnenie
Autori tvrdia, že neexistujú finančné konflikty záujmov.