Indukcia myšieho črevného zápalu adoptívnym prenosom efektorových CD4 CD45RBhigh T buniek

Abstrakt

Existuje mnoho rôznych zvieracích modelov na štúdium patogenézy zápalového ochorenia čriev človeka (IBD), z ktorých každý má svoje výhody a nevýhody. Popisujeme tu experimentálny model kolitídy, ktorý je iniciovaný adoptívnym prenosom vysokých T buniek syngénnej sleziny CD4 + CD45RB do príjemcov myší s deficitom T a B buniek. Populácia CD4 + CD45RB s vysokými T bunkami, ktorá sa vo veľkej miere skladá z naivných efektorových buniek, môže indukovať chronický črevný zápal, veľmi podobný dôležitým aspektom ľudskej IBD. Týmto postupom je možné manipulovať, aby sa preskúmali aspekty nástupu a progresie ochorenia. Okrem toho sa môže použiť na štúdium funkcie vrodených, adaptívnych a regulačných populácií imunitných buniek a úlohy faktorov životného prostredia, to znamená mikroflóry pri zápaloch čriev. V tomto článku vysvetľujeme metódu indukcie kolitídy pomocou protokolu krok za krokom. Patrí sem videoukážka kľúčových technických aspektov potrebných na úspešný vývoj tohto modelu myši s experimentálnou kolitídou na výskumné účely.

Protokol

POZNÁMKA: Zaistite, aby všetky protokoly o zvieratách boli schválené a v súlade s predpismi Inštitútu pre starostlivosť o zvieratá a ich použitie (IACUC) a Príručky národnej rady pre výskum o starostlivosti a používaní laboratórnych zvierat. Myši darcu môžu byť buď samci alebo samice, ale myšami príjemcu by mali byť samce. Ak sa majú použiť samičky, musia byť darcovskými myšami samice. Pravidelne udržiavajte kolónie pomocou nesterilných lôžok a nekyslenej vody, pretože tieto ovplyvňujú črevnú flóru a tým aj fenotyp kolitídy u myší 5,6.

  1. Používajte ľadovo chladné médiá a pufre. Počas experimentu držte bunky na ľade.
  2. Experiment vykonajte v sterilnom biologicky nebezpečnom digestore pomocou sterilnej technológie.

2. Izolácia T buniek sleziny

3. Obohatenie CD4 + T buniek

Poznámka: Postupujte podľa pokynov výrobcu pre konkrétne výrobky použité v tejto časti.

4. Označovanie a triedenie buniek 7

črevného
Obrázok 1: Reprezentatívne grafy prietokovej cytometrie populácií T buniek CD4 + CD45RB počas analýzy FACS (A. - C) FITC CD4- a PE CD45RB zafarbené splenocyty od darcovských myší C57BL/6 boli roztriedené pomocou FACS na CD4 + CD45RB vysoké a CD4 +. Populácie CD45RB nízkych T buniek. (A) Udalosti dubletu vylúčené na prednom rozptylovom grafe. (B) Lymfocyty sa spojili v predných a bočných rozptylových grafoch. (C) CD4 + T bunky sa uzavreli a (D) CD4 + CD45RB + T bunky sa vyniesli na histogram PE proti udalostiam. Nízke bunky CD4 + CD45RB sa považovali za najnižších 20% buniek CD45RB +. Bolo zistené, že vysoké bunky CD4 + CD45RB sú 40% najvyššie bunky CD45RB +.

  1. Spustite alikvotný podiel každej bunkovej populácie na prístroji FACS na vyhodnotenie čistoty populácie.
  2. Bunky s veľkosťou centrifugujte pri 450 g po dobu 7 minút a resuspendujte v 1 ml PBS. Odstráňte alikvoty buniek, aby ste spočítali a vyhodnotili životaschopnosť buniek vylúčením trypánovej modrej ako v kroku 2.9.

5. Injekcia buniek príjemcom

  1. Resuspendujte triedené bunky na 4 x 106 buniek/ml (CD45RB vysoké) alebo 2 x 106 buniek/ml (CD45RB nízke) v PBS.
  2. Preneste 100 μl buniek s vysokým obsahom CD45RB na príjemcu do nových sterilných skúmaviek. Do tejto skúmavky pridajte 100 μl PBS na príjemcu. Celkové množstvo injikované na zviera je 200 μl a celkové množstvo buniek na príjemcu je 4 × 105 vysoko naivných T buniek CD4 + CD45RB.
  3. Ak je požadovaná experimentálna skupina obsahujúca regulačné T bunky, potom pridajte 100 μl buniek CD45RB na príjemcu do nových sterilných skúmaviek. 100 μL CD45RB nízkych buniek na príjemcu v tej istej skúmavke. Celkové injekčné množstvo na zviera je 200 ul; Pomer vysokých buniek CD45RB: nízkych buniek CD45RB je 2: 1.
  4. Vstreknite 100 μl buniek CD45RB vysoko alebo CD45RB vysoko/nízko CD45RB CD4 + intraperitoneálne do pravej a ľavej strany brucha (celkovo 200 μl) každého príjemcu.

6. Monitorovanie progresie ochorenia u prijímajúcich zvierat

  1. Na vyhodnotenie klinického stavu zvierat, ktoré dostali príjemcu, je celkovému klinickému skóre pre nasledujúce parametre pridelené 8 v deň injekcie, potom každý týždeň a po usmrtení:
    1. Určite plytvanie meraním chudnutia: 0 - žiadne chudnutie; 1 - 0,1 až 10% strata pôvodnej telesnej hmotnosti; 2 - viac ako 10% úbytku pôvodnej telesnej hmotnosti (Obrázok 2A).

črevného
Obrázok 2: Klinické a patologické príznaky zápalu po prenose divokého typu CD4 + CD45RB vysokých T buniek sa vyskytujú u myší príjemcov Rag1 -/- a NRDKO 11 (A) Príjemcovia NRDKO stratili v priemere 10% svojej pôvodnej telesnej hmotnosti 5. Týždne po prenose, zatiaľ čo Rag1/príjemcovia v tom čase nevykazujú klinické príznaky choroby. Každý bod predstavuje priemerné percento počiatočnej telesnej hmotnosti pre kohortu ± SEM. ** P -/- a NRDKO prijímajúce myši sú zhrubnuté a skrátené v porovnaní s dvojbodkami z Rag1 -/- a NRDKO myší bez adoptívneho prenosu T-buniek. Kolónky z myší príjemcov NRDKO vykazujú závažný zápal a zvýšenú obezitu (údaje nie sú uvedené). Kliknutím sem zobrazíte väčšiu verziu tohto obrázka.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Spoľahlivo je izolovaných približne 10 x 106 CD4 + CD45RB vysokých T buniek z 10 slezín dospelých myší C57BL/6 darcu. Tento počet sa bude líšiť v závislosti od veku a kmeňa darcovskej myši a od schopností výskumného pracovníka. Keď sa 4 x 105 C57BL/6 CD4 + CD45RB vysokých T buniek prenesie do myší príjemcov C57BL/6 Rag1 -/-, klinické príznaky ochorenia sa objavia okolo 5 týždňov po nasýtení alebo skôr, ak sú myši geneticky náchylné na závažnejšie ochorenie ( Obrázok 2, 3) 11.12. CD3 + T bunky možno vidieť v hrubom čreve u príjemcu Rag1 -/- už po 3 týždňoch (3A) 12.

myšieho
Obrázok 3: Prenos štandardného CD4 + CD45RB vysoké T bunky v Rag1 -/- a RKO/δ KD príjemcoch indukujú chronický zápal čriev 12 (A) (Originálne zväčšenie 10X, H&E a CD3 Imunohistochémia). Farbenie H&E (horné panely) ukazuje epiteliálnu hyperpláziu, infiltrované zápalové bunky a kryptické abscesy (šípka) prítomné u príjemcu RKO/8 KD, ale nie u príjemcu Ragl -/-. Dvojbodky z myší príjemcov RKO/8 KD vykazovali významnú akumuláciu CD3 + T buniek CD3 IHC (spodné platne) v porovnaní s dvojbodkami od príjemcov Rag1 -/-. (B) Kolónky z RKO/8 KD recipientných myší vykazovali závažnejší zápal v porovnaní s dvojbodkami z Rag1 -/- recipientných myší, ako bolo určené histologickým skóre. (C, D) Kultúry explantátu z hrubého čreva z RKO/8 KD recipientných myší vylučovali menej IL-10 (C) a IL-12p40 (D) ako hotové kultúry Rag1 -/- pre explantáciu hrubého čreva. Myši prijímača kliknutím zobrazíte väčšiu verziu obrázka.

Predtým sme publikovali, že pri adoptívnom prenose T-buniek v Nfil3 -/-/Rag1 -/- príjemcoch dvojitého knockoutu (NRDKO) sa v porovnaní s myšami príjemcami Rag1 -/- vyvinula závažná kolitída. (Obrázok 2) 11. NFIL3 negatívne reguluje IL-12p40 v makrofágoch hrubého čreva bez ohľadu na jeho účinok indukujúci IL-10 13. Dysregulácia IL-12p40 a IL-10 je v patogenéze ľudskej IBD 1. Nekontrolovaná produkcia IL-12p40 teda adoptívnym prenosom Myši, ktoré dostávali NDRKO, majú za následok rýchlejšiu progresiu ochorenia, ako je napríklad chudnutie (2A) zobrazené. U niektorých myší prijímajúcich NRDKO sa vyskytlo vážne ochorenie, ktoré malo za následok prolaps čreva (2 B). Hrubé hrubé črevá myší prijímajúcich NRDKO sú zhrubnuté a skrátené, čo vedie k veľkej imigrácii zápalových buniek do hrubého čreva v porovnaní s myšami príjemcami Rag1 -/- (2C).

V porovnaní s myšami Rag1 -/- s nefunkčnou katalytickou jednotkou p110 ô PI3K v populáciách nelymfocytov (RKO/8 KD) vyvolali vysoké T bunky CD4 + CD45RB podobne rýchly a závažný klinický priebeh ochorenia v porovnaní s replikáciou NRDKO myši (3) 12. Histologická analýza po 3 týždňoch ukazuje hypertrofiu tkaniva hrubého čreva, zápal, infiltráty konzervatívnych buniek a kryptické abscesy (šípka) u príjemcu RKO/8 KD v porovnaní s príjemcom Rag1 -/- (3A). Myši príjemcov boli v tomto experimente usmrtené 3 týždne kvôli významnému počtu, ktoré stratili 20% svojej pôvodnej hmotnosti. Histologické skóre, zaslepené voči testovaným skupinám patológom a stanovené na základe špecifických kritérií vyvinutých v našom laboratóriu 12, bolo v porovnaní s Rag1 vyššie u RKO/δ KD recipientných myší -/- recipientných myší (3B). Okrem toho spontánna produkcia cytokínov z kultúr explantátu hrubého čreva ukázala zníženú produkciu IL-10 a IL-12p40 u RKO/8 KD recipientných myší v porovnaní s Ragl -/- recipientnými myšami (3C, D) 12. Opäť zvýšenie IL-12p40 a zníženie produkcie IL-10 implikované v patogenéze ľudskej IBD 1.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Diskusia

Tu popisujeme postupný protokol indukcie zápalu hrubého čreva u myší adoptívnym prenosom CD4 + CD45RB + T buniek u imunodeficientných myší. Použili sme darcovskú slezinu C57BL/6 a syngénne myši príjemcu Rag1 -/-, aj keď iné kmene (napr. BALB/c, 129S6/SvEv, neobézny diabetik (NOD)) a genetické modely imunodeficiencie (napr. SCID, Rag2 -/- ), možno použiť aj 4,14-16. Je dobre známe, že kmeň pozadia ovplyvňuje závažnosť experimentálnej kolitídy u myší 1. Okrem toho sa enterická mikroflóra v myšej populácii významne líši medzi inštitúciami, vrátane medzi tými, ktoré sú v tej istej inštitúcii 6,17. Zatiaľ čo 2 a 3 nepreukázali vývoj kolitídy u Rag1 -/- myší po 4 týždňoch po prevode, podľa našich skúseností a u iných príjemcov Rag1 -/- k rozvoju klického ochorenia medzi 6 a 9 týždňami po prevode CD4 + CD45RB high -T -Bunky 18-23. Táto variabilita klinického priebehu a expresie ochorenia by sa mala udržiavať čo najmenšia pri nastavovaní tohto modelu experimentálnej kolitídy na intra- a inter-experimentálnu nekonzistenciu.

Kroky protokolu, ktoré si vyžadujú optimalizáciu, sú Časť 3: Obohatenie CD4 + T buniek a Časť 4: Značenie a triedenie buniek. Optimalizácia obohatenia buniek CD4 + T závisí od použitého magnetického systému a mala by sa riadiť pokynmi výrobcu. Možnosti systému separácie magnetických buniek sú uvedené v dokumente Tabuľka konkrétnych reagencií/príslušenstva uvedené. Je vhodné obohatiť pre CD4 + T bunky negatívnou selekciou, pretože priame značenie tejto populácie môže ovplyvniť fenotyp buniek. Na značenie buniek na FACS je k dispozícii veľa protilátkových klonov. Koncentrácia protilátky (krok 4.4) by mala byť optimalizovaná tak, aby sa zabezpečilo špecifické zafarbenie a adekvátna separácia populácií T buniek CD4 + CD45RB počas FACS.

Tu popisujeme metodiku dobre charakterizovaného modelu myší s adaptívnym prenosom chronického zápalu tenkého čreva a hrubého čreva, ktorý sa podobá ľudskej IBD 5. Tento podrobný protokol poskytuje kľúčové techniky úspešného vývoja týchto postupov na výskumné účely. Toto je obzvlášť užitočný zvierací model ľudskej IBD, pretože umožňuje synchronizáciu ochorenia a manipuláciu s rôznymi populáciami buniek. Avšak myši s oslabeným imunitným systémom sú geneticky modifikované bez toho, aby vyvíjali zrelé adaptívne imunitné bunky, ktoré pravdepodobne ovplyvňujú následné chorobné procesy. Aj napriek tomu sa tu opísaná metóda ukáže ako veľmi užitočná v budúcich štúdiách, ktoré určia účinky enterickej mikroflóry, buniek vrodeného imunitného systému a adaptívnych imunitných regulačných buniek v patogenéze ľudskej IBD.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Poďakovanie

Táto práca bola podporená cenou Americkej spoločnosti pre gastroenterológiu (AGA) pre výskumných vedcov a Cenou pre rozvoj kariéry v Crohne a Colitis of America (CCFA) (SZS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS) a Centrom pre gastrointestinálnu biológiu University of North Carolina. and Disease Grants P30 DK34987 (histologické jadro). Základné vybavenie prietokovej cytometrie UNC je čiastočne podporované grantom NCI Center Core Support Grant (P30CA016086) v komplexnom onkologickom centre UNC Lineberger. Ďakujeme Lukasovi B. Borstovi z Veterinárnej lekárskej fakulty Štátnej univerzity v Severnej Karolíne za pomoc s histopatologickou analýzou a imunohistochémiou.