Inhibícia expresie génu ICAM-1 oligonukleotidmi s trojitou špirálou - PDF na stiahnutie zadarmo

Z kliniky a polikliniky pre dermatológiu a alergológiu na Univerzite Ludwiga Maximiliána v Mníchove Riaditeľ: Prof. Dr. med. DR. h.c. G. Plewig Inhibícia expresie génu ICAM-1 oligonukleotidmi s trojitou špirálou Dizertačná práca na získanie doktorandského titulu v odbore biológia človeka na Lekárskej fakulte Univerzity Ludwiga Maximiliána v Mníchove, ktorú predstavil Robert Besch z Mníchova 2003

oligonukleotidmi

So súhlasom Lekárskej fakulty Mníchovskej univerzity Reportér: Prof. Dr. K. Degitz 2. Spravodajca: prof. Dr. P. B. Becker Spolumajiteľ: Dohľad zamestnanca doktorátu: Dekan: Priv.-Doz. G. Hartmann prof. Dr. Th. Brocker Dr. C. Marshal prof. Dr. DR. h.c. K. Peter Deň ústnej skúšky: 28. júla 2003

Inhibícia expresie génu ICAM-1 oligonukleotidmi s trojitou špirálou

Časti tejto práce sú súčasťou nasledujúcej publikácie: Besch, R., Giovannangeli, C., Kammerbauer, C., Degitz, K. Špecifická inhibícia expresie ICAM-1 sprostredkovaná génovým cielením s oligonukleotidmi tvoriacimi triplex J. Biol. Chem. 2002; 277: 32473-32479

Obsah ÚVOD 1. Objav štruktúr trojitej špirály. 1 2. Génová inhibícia pomocou oligonukleotidov. 2 2.1 Inhibícia génov pomocou oligonukleotidov s trojitou špirálou. 2 2.2 Inhibícia génov s antisense oligonukleotidmi. 3 3. Štruktúra trojitej špirály. 4 4. Cieľové sekvencie pre oligonukleotidy s trojitou špirálou. 5 5. Oligonukleotidy s trojitou špirálou. 5 5.1 Základné aspekty pri navrhovaní oligonukleotidov s trojitou špirálou 6 5.1.1 Orientácia základných tripletov. 6 5.1.2 Spojovacie uhly a dĺžky základných trojíc. 7 5.1.3 Vlastnosti a stabilita jednotlivých základných trojíc. 8 5.2 Oligonukleotidy s trojitou špirálou. 8 5.2.1 Oligonukleotidy trojitej skrutkovice pyrimidínového typu. 9 5.2.2 Oligonukleotidy trojitej špirály purínového typu. 9 6. Modifikácie oligonukleotidov Triple Helix. 10 6.1 Úpravy podkladov. 10 6.2 Úpravy chrbtovej kosti. 10 6.3 Úpravy koncov. 11 7. Technológia trojitej špirály. 13 7.1 Biologická aktivita oligonukleotidov s trojitou špirálou. 13 7.2 Dôkazy o vytvorení trojitej špirály. 14 1 Obsah

8. Bunkové adhézne molekuly. 14 nadrodina imunoglobulínov. 15 integrínov. 16 vybratých položiek. 16 kadherínov. 17 9. Molekula bunkovej adhézie ICAM-1. 17 9.1 Výskyt a regulácia ICAM-1. 9.2 Imunologická funkcia ICAM-1. 9.3 Lekársky význam inhibície ICAM-1. 19 9.3.1 Zápalové ochorenia kože. 9.3.2 Iné zápalové ochorenia. 21 9.3.3 Obrana proti odmietnutiu transplantovaných orgánov. 9.4 Proteínová štruktúra ICAM-1. 9.5 Génová štruktúra ICAM-1. 23 MATERIÁL A METÓDY 1. Materiály. 24 1.1 Chemikálie a rozpúšťadlá. 24 1,2 enzýmov. 25 1.2.1 Reštrikčné enzýmy. 25 1.2.2 Ostatné enzýmy. 25 1.3 Protilátky. 25 1.4 Plazmidy. 26 1.5 Biologický materiál. 26 1.5.1 Prokaryotické bunky. 26 1.5.2 Eukaryotické bunky. 26 1.6 Médiá a prísady do médií na kultiváciu eukaryotických buniek. 26 2 Obsah

1,7 oligonukleotidov. 27 1.7.1 Trojitá skrutkovica a kontrolné oligonukleotidy. 1.7.7 Oligonukleotidy použité na produkciu cieľových sekvencií 27 1.7.3 Oligonukleotidy použité ako priméry. 28 1.8 Kompletné obchodné systémy. 29 1.9 Spotrebný materiál. 29 1.10 Zariadenia. 30 1.11 Softvér. 30 2. Metódy. 31 2.1 Techniky DNA. 31 2.1.1 Všeobecné zaobchádzanie s nukleovými kyselinami. 31 2.1.1.1 Čistenie DNA extrakciou fenolom. 31 2.1.1.2 Zrážanie DNA. 31 2.1.1.3 Gélová elektroforéza na agarózových géloch. 31 2.1.1.4 Denzitometrické hodnotenie pásov DNA. 32 2.1.1.5 Izolácia fragmentov DNA z agarózových gélov. 2.1.1.6 Čistenie DNA pomocou silikátových membrán. 33 2.1.1.7 Stanovenie koncentrácie nukleových kyselín. 33 2.1.2 Príprava genómovej DNA z buniek A431. 33 2.1.2.1 Príprava genomickej DNA s aniónovo výmennými stĺpcami. 34 2.1.2.2 Príprava genómovej DNA na stĺpcoch silikátovej membrány. 34 2.1.3 Polymerázová reťazová reakcia. 35 2.1.4 Značenie nukleových kyselín digoxigenínom (DIG). 36 2.1.4.1 Interné značenie nukleových kyselín. 36 2.1.4.2 Značenie 3 koncov nukleových kyselín. 36 2.1.5 Prenos nukleových kyselín na nylonové membrány (blot). 37 2.1.6 Hybridizácia DNA s DIG-značenými sondami (Southern blot). 37 2.1.7 Detekcia DIG-značených nukleových kyselín. 37 3 Obsah

2.5 Dôkazy trojitej špirály. 51 2.5.1 Gélová retardácia. 51 2.5.2 Inhibícia reštrikčných enzýmov. 52 2.5.3 Inhibícia PCR reakcie. 52 2.5.4 Detekcia trojitých skrutkovíc magnetickou separáciou. 53 2.5.4.1 Detekcia trojzávitnice na izolovanej genómovej DNA. 54 2.5.4.2 Detekcia trojitej špirály v bunkových jadrách. 55 VÝSLEDKY 1. Cieľové sekvencie pre oligonukleotidy s trojitou špirálou v géne ICAM-1. 56 1.1 Identifikácia vhodných cieľových sekvencií. 56 1.2 Výber zvlášť vhodných cieľových sekvencií. 57 2. Návrh oligonukleotidov trojitej špirály. 59 2.1 Triple helix oligonukleotidy pre cieľovú sekvenciu 13. 59 2.2 Triple helix oligonukleotidy pre cieľovú sekvenciu 17. 61 2.3 Návrh kontrolných oligonukleotidov. 62 3. Attachment Studies. 63 3.1 Väzbové štúdie s oligonukleotidmi s trojitou špirálou pre cieľovú sekvenciu 13. 63 3.1.1 Väzbové štúdie s cieľovými sekvenciami oligonukleotidov. 63 3.1.2 Väzbové štúdie na plazmide. 65 3.1.2.1 Produkcia plazmidu pcm55 s cieľovou sekvenciou 13. 65 3.1.2.2 Detekcia trojzávitnice pomocou inhibície EcoN I. 66 3.1.3 Väzbové štúdie na preparátoch genómovej DNA. 3.1.3.1 Inhibícia reštrikčného enzýmu Bfa I. 69 3.1.3.2 Detekcia trojzávitnice pomocou magnetickej separácie. 70 3.1.4 Väzbové štúdie prípravkov bunkových jadier. 72 3.2 Väzbové štúdie s oligonukleotidmi s trojitou špirálou pre cieľovú sekvenciu 17. 76 5 Obsah

3.2.1 Záväzné štúdie o cieľových sekvenciách oligonukleotidov. 76 3.2.2 Väzbové štúdie plazmidov. 79 4. Biologická aktivita oligonukleotidov trojzávitnice. 81 4.1 Inhibícia expresie ICAM-1. 81 4.1.1 Stanovenie podmienok transfekcie pre oligonukleotidy 81 4.1.2 Inhibícia ICAM-1 TFO13GT. 4.1.3 Inhibícia ICAM-1 btfo13cu. 86 4.1.4 Štúdie o cytotoxických účinkoch. 87 4.2 Inhibícia reportérových génov. 89 4.2.1 Klonovanie reportérového plazmidu. 89 4.2.2 Inhibícia expresie CAT a vplyv UVA žiarenia. 92 4.2.3 Dodatočné vyšetrenia na preukázanie inhibície génov sprostredkovanej trojitou špirálou. 94 DISKUSIA 1. Väzbová schopnosť oligonukleotidov trojitej špirály. 96 1.1 Štúdie na oligonukleotidoch obsahujúcich cieľové sekvencie. 96 1.2 Štúdie plazmidov obsahujúcich cieľové sekvencie. 98 1.3 Štúdie o genómovej DNA. 99 2. Inhibícia ICAM-1. 102 3. Aktivita oligonukleotidov trojitej závitnice v modelovom systéme. 105 4. Vplyv UVA žiarenia na inhibíciu génov pomocou oligonukleotidov s trojitou špirálou. 106 5. Výhľad. 108 ZHRNUTIE. 110 ZOZNAM LITERATÚRY. 113 PRÍLOHA. 126 6 Obsah

9.5 Génová štruktúra ICAM-1 Gén ICAM-1 sa skladá zo 7 exónov, ktoré sú prerušené 6 intrónmi (obrázok 11). Exónový intrónový promótor 1 2 3 4 5 6 7 1000 bp Obrázok 11: Gén ICAM-1. Proporcionálne znázornenie génu ICAM-1 s exónmi zvýraznenými ako očíslované štvorčeky. Oblasti v prvom a druhom intróne, ktoré neboli zverejnené v čase písania tohto článku, sú označené lomítkami. Celková dĺžka prvého intrónu je asi 4 kb, druhý intrón je dlhší ako 2,6 kb. Preložená oblasť je zobrazená sivou farbou, nepreložené oblasti bielou farbou. Okrem niekoľkých menších prekrytí je každá imunoglobulínová doména proteínu kódovaná jedným z približne 300 bp dlhých exónov (Degitz et al. 1991). Extracelulárne domény 1-5 zodpovedajú exónom 2-6, zatiaľ čo transmembránová a intracelulárna časť proteínu je kódovaná exónom 7 (Voraberger et al. 1991). Silná korelácia medzi genómovou organizáciou a rozdelením proteínu na domény je typická pre nadrodinu imunoglobulínov (Staunton et al. 1988). 23 Úvod

1.2 Enzýmy 1.2.1 Reštrikčné enzýmy 1.2.2 Iné enzýmy Názov alkalická fosfatáza z kreviet Klenowov fragment DNA polymerázy I Pwo-DNA-polymeráza (korektúra polymerázy) T4 DNA ligáza Taq-DNA-polymeráza Terminálna transferáza Zdroj Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) MBI Fermentas (St.Leon-Rot) peqlab (Erlangen) Promega (Heidelberg) peqlab (Erlangen) Roche Diagnostics (Mannheim) 1,3 Reštrikčné enzýmy pre protilátky sa získali od Roche Diagnostics (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), MBI Fermentas (St.Leon-Rot ) alebo získané od spoločnosti Hybaid-AGS (Heidelberg). Špecifickosť Špecifikácia Označenie Zdroj značenia Zdroj Ľudský ICAM-1 Fluoresceín izotiokyanát (FITC) MedSystems Diagnostics (Viedeň, Rakúsko) Ľudský HLA-DR R-Fykoerytrín BD Biosciences (Heidelberg) (PE) Myš IgG1 Fluoresceín Izotiokyanát (Unterschleissheim-Lohhof) BeckIT Coulter (Beckmann Coulter) Myš IgG1 R-fykoerytrín (PE) BD Biosciences (Heidelberg) 25 Materiál a metódy

1.4 Plazmidy Východiskovými plazmidmi na klonovanie reportérových plazmidov boli pcat ™ -Basic a psv ™ -β-galaktozidázová kontrola (Promega, Heidelberg). Plazmid ICAM-1 cDNA (pg4h1), pozostávajúci z pgem ™ -4Z (Promega, Heidelberg), do ktorého bol klonovaný fragment s veľkosťou 2980 bp z ICAM-1 cDNA pomocou EcoRI a SalI, pochádzal od Stauntona et. al. 1988. 1.5 Biologický materiál 1.5.1 Prokaryotické bunky Na replikáciu plazmidu sa použili Escherichia coli (kmeň DH5a). 1.5.2 Eukaryotické bunky Všetky experimenty sa uskutočňovali na bunkách A431 získaných z ATCC (Rockwille, Maryland, USA). 1.6 Médiá a prísady do médií na kultiváciu eukaryotických buniek Názov Názov Amfotericín B Dulbeccovo modifikované Eagle médium (DMEM) Sérum fetálneho teľaťa (FCS) Hanksov pufrovaný soľný roztok (HBSS) L-Glutamín Penicilín Streptomycín Trypsín (0,25%)/EDTA (1 mM) Zdroj Zdroj Životnosť Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) ccpro (Neustadt/Weinstrasse) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) 26 Materiál a metódy

2.2 Oligonukleotidy trojitej špirály pre cieľovú sekvenciu 17 Pre cieľovú sekvenciu 17 boli vyvinuté antiparalelne sa viažuce oligonukleotidy trojitej špirály purínového typu. Pozostávali z guanínu a adenínu (TFO17GA, obrázok 25 A) alebo z guanínu a tymínu (TFO17GT, obrázok 25 B). 3'-TEG TFO17GA GGGGGGAAGGGAGGAAG psoralen C6-5 '5'-CAGTTTTGGGGGGAAGGGAGGAATAAGGCCTC-3' 3'- GTCAAAACCCCCCTTCCCTCCTTATTCCGGAG-5 '3'-TEG B TFO17GT GGGGGGTTGGGTGGTTG psoralen C6-5', 5'-CAGTTTTGGGGGGAAGGGAGGAATAAGGCCTC-3 '3'- GTCAAAACCCCCCTTCCCTCCTTATTCCGGAG- 5 'Obr. 25: Oligonukleotidy trojitej závitnice TFO17GT a TFO17GA. Obrázok 25 A zobrazuje TFO17GA, ktorý sa viaže antiparalelne s purínovým vláknom cieľovej sekvencie 17, a Obrázok 25 B zobrazuje TFO17GT, ktorý sa tiež viaže antiparalelne. Oba oligonukleotidy sa viažu na dvojitú špirálu za tvorby reverzných Hoogsteenových vodíkových väzieb. 5 koncov bolo modifikovaných psoralenom, 3 konce trietylénglykolom. Pretože 5-TpA miesto je na 3-konci homopurínového segmentu, psoralen sa naviazal na 5-koniec oligonukleotidu s trojitou špirálou. Na 5 koniec sa pridal bázický guanín v oligonukleotide s trojitou špirálou, aby sa psoralen dostal do polohy vhodnej na interkaláciu. Voľné 3 konce boli modifikované trietylénglykolom. 61 výsledkov

2.3 Dizajn kontrolných oligonukleotidov Oligonukleotidy so zmiešanou sekvenciou, ktoré majú rovnakú dĺžku a rovnaké základné zloženie ako zodpovedajúce oligonukleotidy s trojitou špirálou (kódovaná kontrola), slúžili ako kontroly. Dbalo sa na to, aby distribúcia báz bola čo najviac podobná pridruženým oligonukleotidom s trojitou špirálou. Pre oligonukleotid s trojitou špirálou btfo13cu, ktorý sa môže viazať iba v paralelnej orientácii, bol ako kontrola navrhnutý oligonukleotid s invertovanou sekvenciou (vymenené 3 a 5 konce). Okrem rovnakého zloženia majú invertované oligonukleotidy tiež rovnakú distribúciu báz. Boli označené inv (pre obrátené). Tiež sa zabezpečilo, že modifikácie kontrolných oligonukleotidov zodpovedali modifikáciám oligonukleotidov s trojitou špirálou. Analogicky k oligonukleotidom s trojitou špirálou sa zabezpečilo, že kontrolné oligonukleotidy neboli schopné hybridizácie s ICAM-1 mRNA (antisense účinky). Sekvencia všetkých kontrolných oligonukleotidov so zodpovedajúcimi oligonukleotidmi s trojitou špirálou, pre ktoré sa použili, je uvedená v časti venovanej materiálom (oddiel 1.7.1, strana 27). 62 výsledkov

Pokiaľ bol TFO17GA inkubovaný s plazmidom pg4hl v inkubačnom pufri (bez obsahu draslíka) a ožarovaný, bola zo 100-násobného molárneho nadbytku trojitého helixového oligonukleotidu detegovateľná inhibícia PCR reakcie. Ďalšie zvýšenie množstva TFO neviedlo k väčšej inhibícii. Je potrebné poznamenať, že PCR reakcii sa zabráni iba vtedy, ak boli obidve vlákna DNA zosieťované (bisadukty), pretože v prípade monoadukcií je stále k dispozícii opačné vlákno amplifikácie PCR. Úplná inhibícia PCR reakčnej zmesi je preto nepravdepodobná. Pokiaľ inkubácia prebiehala v tlmivom roztoku obsahujúcom draslík, boli pozorované podobné výsledky, pričom inhibícia bola detegovateľná iba z 1 000-násobného nadbytku TFO. Tento výsledok tiež súhlasí so zníženou tvorbou trojitej špirály v pokusoch s retardáciou gélu v prítomnosti draslíka. PCR reakcia nebola inhibovaná bez ožiarenia. Porovnanie plazmidových pásov ukázalo, že množstvo použitého plazmidu bolo približne rovnaké vo všetkých dávkach a že rozdiely v množstve produktu PCR sú založené na inhibícii PCR a nie na rôznych množstvách použitého plazmidu. 80 výsledkov

4.1.3 Inhibícia ICAM-1 prostredníctvom btfo13cu Po inhibícii expresie ICAM-1 antiparalelným viazaním trojzávitnicovým oligonukleotidom TFO13GT sa uskutočňovali experimenty s paralelným viazaním btfo13cu. Tento oligonukleotid mal tiež inhibičný účinok na ICAM-1 (obrázok 47). ICAM-1 HLA-DR Neošetrený E neošetrený B IFNyF IFNyC btfo13cu G btfo13cu D bcoinvcu H bcoinvcu Obrázok 47: HLA-DR expresia a ICAM-1 expresia buniek A431 po transfekcii btfo13cu. Vľavo je zobrazené farbenie pomocou FITC-značenej anti-ICAM-1 protilátky, vpravo je farbenie s PE-konjugovanou anti-HLA-DR protilátkou. Bunky boli buď neošetrené (obrázok 47 A a E), ošetrené IFNy (obrázok 47 B a F) alebo transfekované pred ošetrením IFNy 2 um btfo13cu (obrázok 47 C a G) alebo 2 um bcoinvcu (obrázok 47 D a H). Bol. 86 výsledkov