Kardiálna fenotypizácia myší s deficitom TASK-1 a Pannexin-1 - PDF zadarmo

Kardiálna fenotypizácia myší s deficitom TASK-1 a pannexínu-1 INAUGURAL DISSERTATION to obtain the doctor Dr.med.vet at the Department of Veterinary Medicine at the Justus Liebig University Giessen Stella Schulte (rodená Petrić)

task-1

Predkladá Ústav pre farmakológiu a toxikológiu Univerzity Justusa Liebiga v Gießene Školiteľ: Prof. Dr. Joachim Geyer a z kliniky pre detskú kardiológiu a pneumológiu na univerzitnej klinike Düsseldorf Vedúci: Prof. Dr. Birgit Donner Srdcová fenotypizácia myší s deficitom TASK-1 a pannexínu-1 INAUGURAL DISSERTATION na získanie titulu Dr.med.vet na Katedre veterinárneho lekárstva Univerzity Justusa Liebiga v Giessene, ktorú predložila veterinárna lekárka Stella Schulte (rodená Petrić) z Freiburgu Gießen 2016

So súhlasom Katedry veterinárneho lekárstva Univerzity Justusa Liebiga Gießen dekan prof. Dr. DR. Martin Kramer recenzent prof. Dr. Joachim Geyer prof. Dr. Deň sporu Birgit Donner 10. mája 2017

Úvodná vlna pretína izoelektrickú líniu (Mitchell a kol., 1998; Chaves a kol., 2003; Swynghedauw a Aubert, 2003; pozri obrázok 1.6). R R R R P S Q R R R R Koniec T-vlny (koniec repolarizácie) P S Obrázok 1.6: Ručné definovanie konca T-vlny pomocou myši. Modified from Mitchell et al., 1998 Priesečník vlny T a izoelektrická línia je definovaný ako koniec repolarizácie. Q Fyziologická kľudová srdcová frekvencia myši je okolo 550 - 620 úderov za minútu (min -1; Takuma a kol., 2001; Kass a kol., 1998), čo je významne vyššia frekvencia ako u ľudí s priemerom 70 úderov za minútu (Doevendans et al., 1998; Silbernagel a Despopoulos, 2003). PR, RR, QRS a QT intervaly sú u myší zodpovedajúcim spôsobom kratšie. V súhrne možno povedať, že akčné potenciály a anatomická štruktúra srdca, ako aj expresia iónových kanálov týchto dvoch druhov sa navzájom líšia, ale v podstate umožňujú prenos výsledkov výskumu z myši na človeka. Podľa súčasného stavu vedomostí je to určite najlepší zo všetkých možných systémov základného výskumu. 9

Úvod 1.5.3 Využitie, vývoj a možnosti knock-out myší Prípravné práce na vývoj knock-out myší priniesli Američanovi Mario Capecchimu a jeho dvom britským výskumným kolegom Sirovi Martinovi Evansovi a Oliverovi Smithiesovi Nobelovu cenu za medicínu za rok 2007. Knock-out myši sú zatiaľ jedinými tvormi vytvorenými v laboratóriu pomocou transgénnych techník, pri ktorých bol jeden alebo viac génov úspešne a konkrétne vypnutý. Stratia svoju funkciu a umožňujú výskumníkom vyvodiť závery o ich úlohe pri (dedičných) chorobách. S našimi dvoma šľachtiteľskými líniami, myšami pannexin-1 a TASK-1, máme pre experimenty k dispozícii takéto knock-out myši. Napriek tomu zostáva posledná otázka prenosnosti výsledkov na človeka vždy. 10

Úvod 1.5.4 Produkcia knock-out myší 1. Bunková kultúra (embryonálne kmeňové bunky, ES) Obrázok 1.7: Produkcia knock-out myší Modifikované podľa Graw, 2007 Cieľový vektor sa transfekuje do bunkovej kultúry embryonálnych kmeňových buniek a homológna rekombinácia zabudované do DNA kmeňových buniek. V dôsledku proliferácie zmenených buniek sa nakoniec vytvorí bunková populácia so zmeneným génom, ktorá sa injektuje do myších blastocýst. Tieto blastocysty sa vkladajú do samíc myší prenosom embryí a prenášajú sa nimi. Narodené myši nesú buď výlučne normálny genetický materiál (divokého typu), alebo takzvané mozaikové myši, polovica je divokého typu a polovica geneticky modifikovaná. Posledné menované sú heterozygotné. Spätné kríženie s heterozygotnými myšami nakoniec vedie k homozygotným vyradeným myšiam. 11

Úvod ES2-247 ES1-84 CE-395 CE-494 IS-169 CE-379 IS = intracelulárna slučka; ES = extracelulárna slučka; CE = koncový koniec karboxylovej skupiny (čísla za každým ukazujú na aminokyselinové polohy transmembránových domén) Obrázok 1.9: Štrukturálne porovnanie troch rôznych génov pre pannexín u myši Modifikované podľa Penuela et al., 2009 Všetky 3 gény pre myš pannexínu majú 4 transmembránové domény (každý pozostáva z 20 aminokyselinových koncov), rovnako ako 2 extracelulárne slučky a intracelulárny karboxylový a amino-koncový koniec. Karboxylový koniec pannexínu-2 je oveľa dlhší ako koniec ostatných dvoch pannexínov. 1.6.2 Expresia a funkcia pannexínu-1 Pannexín-1 je jediný z troch proteínov pannexínu, ktorý je možné detekovať všadeprítomne (Barbe et al., 2006); jeho expresia je obzvlášť silná v erytrocytoch, endotelových bunkách a astrocytoch, kde sa uvoľňujú. ATP (Wang et al., 2007). Jeho expresia v myšom srdci (Ray a kol., 2005; Nishida a kol., 2008) sa zvyšuje tlakom (Nishida a kol., 2008). Okrem srdca myši bol pannexín-1 detekovaný aj v sarkolemme psích kardiomyocytov (Dolmatova et al., 2012). 15

Úvod Okrem toho sa v tejto práci predpokladá, že elektrofyziologické vyšetrovanie (EPU) bude zahŕňať prechodné a žiaruvzdorné časy, ako aj zraniteľnosť myší TASK-1 +/+ a TASK-1 -/- in vivo pomocou programovania generovaného oktapolárnym katétrom je možné určiť intrakardiálnu stimuláciu. 25

Materiál a metódy 2 Materiál a metódy 2.1 Genotypizácia myší WT a KO Pannexin-1 a TASK-1 2.1.1 Príprava DNA zo špičiek chvosta Príprava DNA pomocou súpravy DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) sa uskutočňovala približne od Vykostené koncovky chvosta dlhé 3 mm, ktoré sa myšiam vybrali, keď sa odstavili súčasne s označením na uchu. Vzorka tkaniva Rozpustenie bunkových stien Väzba DNA Premývací proces Obrázok 2.1: Princíp prípravy DNA upravený podľa príručky súpravy DNeasy Blood and Tissue Kit V priebehu prvého kroku proteináza K rozpúšťa bunkové steny a uvoľňuje ich DNA. Rôzne pufre potom umožňujú optimálne naviazanie DNA na membránu DNEasy špeciálne dodávaných skúmaviek. Dva premývacie procesy nakoniec vedú k odstráneniu nepoužiteľného materiálu a inhibítorov enzýmov a čistej DNA, ktorá sa má eluovať, a je pripravená na použitie. Elúcia Čistota DNA pripravená na použitie a koncentrácia DNA sa stanovili fotometricky (NanoDrop 1000, Thermo Scientific, USA). 26

Materiál a metódy viditeľný zväzok Jeho excitácie. Spravidla to bolo najjasnejšie vidieť na záznamoch, v ktorých bola amplitúda predsieňovej excitácie takmer taká veľká ako amplitúda komory. Predsieň excitácie jeho zväzku (A) A His začiatok: predsieňový signál V začiatok: ventrikulárna stimulácia (V) Obrázok 2.6: Meranie jeho zväzku u myší s pannexínom 1 +/+. Snímanie (záznam signálu) pomocou e3e4 Hisov zväzok sa dal najlepšie rozpoznať, keď boli amplitúdy predsieňovej a komorovej excitácie počas intrakardiálneho záznamu podobné vysoké. Ak sa našiel zväzok jeho excitácie, pre každú myš sa zaznamenalo šesť po sebe idúcich srdcových úderov, pokiaľ ide o AH (začiatok predsieňovej stimulácie až do zväzku His), HV (zväzok His až do začiatku komorovej stimulácie) a AV interval (začiatok predsiení až do Začiatok budenia komory). Uskutočnili sme to na šiestich pannexin-1 a piatich myšiach TASK-1 oboch genotypov. Priemerné hodnoty na zviera sa štatisticky vyhodnotili. 38

Materiál a metódy 2.8 Telemetrické vyšetrenia na myšiach pannexin-1 +/+ a pannexin-1 -/- 2.8.1 Základy U myší je možné dlhodobé EKG zaznamenávať iba pomocou vysielačov umiestnených subkutánne alebo intraperitoneálne. Sú dobrým spôsobom na dosiahnutie ťažko udržiavateľného pokojového srdcového rytmu u myší bez vplyvu omamných látok (Bernstein, 2003; Berul 2003). Signály EKG sú zaznamenávané dvoma elektródami, vedené na platne prijímača, filtrované maticou (obe DSI Data Sciences, Minneapolis, USA) a nakoniec sú viditeľné počítačovým programom (LabChart 7). Obrázok 2.8: Naše telemetrické vysielače Vysielače sme implantovali sami subkutánne (model ETA-F10 od DSI). 1 Na subkutánnu implantáciu približne 1,6 g ťažkého vysielača sa použili samce a samice pannexínu-1 WT a vyradené myši vo veku 3 až 6 mesiacov a s hmotnosťou najmenej 23 g (DSI Data Sciences, Minneapolis, USA). použité. Ako je to u hlodavcov obvyklé, všetky zvieratá mali voľný prístup k potrave a vode, kým nebola vyvolaná anestézia. 1 http://www.datasci.com/products/implantable-telemetry/mouse-(miniature )/eta-f10 43

Materiál a metódy 2.8.2 Prípravy na implantáciu vysielača Hneď ako zvieratá dosiahli intraperitoneálnu injekciu ketamínu a xylazínu, do štádia tolerancie anestézie, zafixovali sme ich do polohy ležmo na ohrievaciu platňu (HAT 007, Minitüb GmbH, Tiefenbach). Vaše končatiny boli k nim pripevnené pomocou lepiacich prúžkov, zatiaľ čo sme oči ošetrovali komerčne dostupnými očnými masťami (napr. HYLO -Gel, Ursapharm, Saarbrücken), aby sme chránili pred dehydratáciou. Testovaným zvieratám bol cez latexovú plynovú masku dodávaný kyslík 0,5 l/min (Linde AG, Pullach) a 1,5 obj.% Izofluránu (Isoflurane Actavis, Actavis, Mníchov). Boli na sacom zariadení z plexiskla, ktoré bolo vyrobené špeciálne na tento účel a ktoré malo zabrániť úniku vzduchu obsahujúceho izoflurán. Obrázok 2.9: Myš na operačnom stole Myš na sacom zariadení z plexiskla a na vykurovacej podložke. Modrý kúsok latexu slúžil ako plynová maska. Počas týchto príprav sa sterilný vysielač a 1 ml zmiešaná striekačka vyrobená z 5% glukózy a fyziologického soľného roztoku predhriala na vodnom kúpeli. 44

Materiál a metódy Na konci vyšetrovania boli myši usmrtené, telemetrické vysielače odstránené a vyčistené a dezinfikované pomocou roztokov Gigazyme a Gigasept (Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt). 2.8.5 Zaznamenávanie dlhodobých EKG, analogické s Kramerom a kol. (1998) sme začali zaznamenávať 24-hodinové EKG desať dní po implantácii vysielača. Aby nedošlo k podráždeniu alebo zmenám správania, zvieratá zostali počas záznamu v jednotlivých klietkach. V dňoch zaznamenávania EKG sa dávalo pozor, aby sa zabránilo neobvyklému vystaveniu ľuďom a hlukom v miestnosti pre zvieratá, aby nedošlo k narušeniu inverzného rytmu deň-noc. Všetky zariadenia potrebné na záznam EKG, ako napríklad napájacie laboratórium, počítač, monitor, záznamové platne, skrinka a rôzne napájacie káble, boli pred uvedením do príslušnej miestnosti pre zvieratá dôkladne dezinfikované (Incidin Liquid, Ecolab, Monheim). Dáta boli zaznamenané pomocou softvéru LabChart 7 (ADInstruments, Spechbach) a vzorkovacou frekvenciou 1 kHz. PC s analytickým softvérom Vysielač Input-Matrix Receiver Obrázok 2.11: Schematické znázornenie dlhodobého záznamu EKG Modified from Kramer, 2000 47

Materiál a metódy 2.8.7.1 Plávanie Plavecké experimenty (SV) sa v experimentálnej medicíne zvierat považujú za pohyb s konštantnou námahou, ktorý vedie k submaximálnej námahe (Bernstein et al., 2003). Po telemetrickom zaznamenaní pokojového EKG počas piatich minút zvieratá plávali jednotlivo ďalších päť minút v klietke Makrolon veľkosti II (15 cm vysokej a naplnenej vodou z vodovodu pri teplote 37 - 39 ° C). Ak boli jednotlivé zvieratá ponorené z dôvodu vyčerpania, boli krátko podporené ručne. EKG sa zaznamenávalo počas plávania a počas 10 minút po cvičení, keď sa myši vrátili do svojich klietok. Obrázok 2.12: Myš pri plávaní s manuálnou podporou Pre vyhodnotenie sme pokus o plávanie rozdelili do troch fáz takto: Tabuľka 1: Načasovanie pokusu o plávanie Fáza Trvanie (min) Aktivita 1 0 až 5 Odpočinok 2 5 až 10 Plávanie 3 10 až 20 Obnova 2.8.7.2 Ergometria bežeckého pásu Dosiahnutie fyzického stresu pomocou bežiaceho pásu sa považuje za zlatý štandard pre kontrolu kardiovaskulárneho stresu u ľudí alebo iných veľkých cicavcov 49

Materiál a metódy Udržujte rýchlosť chôdze so sklonom alebo bez neho a končite, keď sú zvieratá vyčerpané (Desai a kol., 1999; Kemi a kol., 2002; Massett a Berk, 2005; Niebauer a kol., 1999). Náš prvý protokol o bežeckom páse I bez stúpania (pozri tab. 2) bol obmedzený na priamu trasu, počas ktorej sa rýchlosť neustále zvyšovala, až kým nenastala únava. Tabuľka 2: Protokol bežeckého pásu I bez sklonu Čas (min) Druhý protokol behúňa II so sklonom sa uskutočňoval najskôr 2 dni po prvom, aby sa zvieratám poskytla doba regenerácie. Okrem stáleho zvyšovania rýchlosti boli každé štyri minúty zavedené stúpania v 5 krokoch od 0 do 25 (pozri tabuľku 3). Rýchlosť (m/min) Čas (min.) Rýchlosť (m/min) 0 2 20 13 2 3 22 14 4 5 24 15 6 6 26 16 8 7 28 17 10 8 30 18 12 9 32 19 14 10 34 20 16 11 36 21 18 12 38 22 Tabuľka 3: Protokol bežeckého pásu II so sklonom Čas (min.) Rýchlosť (m/min) Nastavenie rampy (stupne) Čas (min.) Rýchlosť (m/min) Nastavenie rampy (stupne) 0 2 0 16 10,2 20 2 3 "18 11,4" 4 3,3 5 20 12,5 25 6 4,5 "22 13,7" 8 5,6 10 24 14,8 "10 6,8" 26 15,9 "12 7, 9 15 28 16,5 "14 9,1" 30 17,7 "51

MATERIÁL A METÓDY Ihneď po začiatku vyčerpania sa zvieratá vrátili do svojich klietok a počas 10-minútovej fázy zotavenia sa zaznamenávalo ich EKG. U každej myši bola zaznamenaná prekonaná vzdialenosť a rýchlosť v čase únavy. Fáza zotavenia vždy prebiehala pod pozorovaním a boli zaznamenané akékoľvek abnormality. Obrázok 2.14: Myš na priamom bežeckom páse Ak boli ukončené obidva protokoly o bežiacom páse a súvisiace fázy obnovy, zvieratá boli zabité dislokáciou krčka maternice. Potom sa použili na stanovenie parametrov tela. Rovnako ako v prípade testu plávania boli aj testy na bežeckom páse rozdelené do troch rôznych častí, ktoré sa majú vyhodnotiť:

Materiál a metódy Vďaka vysokej snímkovej frekvencii a dobrému priestorovému rozlíšeniu sú teraz možné aj echokardiografické vyšetrenia na malom srdci myši s jeho vysokou srdcovou frekvenciou. Echokardiografia sa uskutočňovala s prístrojom Vevo 2100 (FUJIFILM Visual Sonics Inc., Toronto, Kanada) a lineárnym prevodníkom MS 400 s 18 - 38 MHz. 10 srdcových tepov bolo spriemerovaných na nameranú hodnotu u 14 myší s nedostatkom pannexínu-1 +/+ - a 12 myší s nedostatkom pannexínu-1. Obrázok 2.15: Ultrazvukové zariadenie, ktoré sme použili 2 Všetky myši boli vyšetrené echokardiografiou najskôr dvanásť dní po implantácii vysielača. 2.9.2 Vykonanie echokardiografie Indukcia anestézie sa uskutočňovala pomocou 5% izofluránu (Isoflurane Actavis, Actavis, Mníchov) a 0,5 l/min kyslíka (Linde AG, Pullach) a pri konštantnom prietoku kyslíka sa znížila na 1,5% izofluránu. Aby bol vplyv anestetického plynu na kardiovaskulárny systém čo najmenší. Zvieratá by mali byť iba nepohyblivé. Na účely vyšetrenia boli myši umiestnené na chrbte na vyhrievanú platňu systému Vevo, ktorá bola predhriata na telesnú teplotu a slúžila tiež ako pohyblivý stôl, 2 www.visualsonics.com/vevo2100 54

Materiál a stanovené metódy. Za týmto účelom jej labky zafixovali lepiacimi prúžkami na senzoroch na zaznamenávanie EKG, jej hlava bola umiestnená do plynovej masky a telesná teplota bola monitorovaná pomocou rektálneho senzora. Aby sme udržali ultrazvukové snímky čo najviac bez artefaktov, oholili sme si myši v oblasti hrudníka (Contura, Wella, Darmstadt). Obrázok 2.16: Myš počas echokardiografie Testované zviera leží počas echokardiografie na ohrievacom stole a cez masku dostáva anestetický plyn (izoflurán). Na účely monitorovania sú jeho končatiny pripevnené k senzorom EKG lepiacou páskou a rektálny senzor (modrý) zaznamenáva telesnú teplotu. Pre lepší prehľad sme ako prvý obrázok zvolili parasternálnu dlhú os. V tomto nastavení sa zaznamenal aortálny prietok, priemer krúžku aortálnej chlopne, dĺžka srdca a M-režim na meranie hrúbky steny. 55

Materiál a metódy Obrázok 2.17: Meranie dĺžky diastolického srdca a vnútorného obvodu srdca v parasternálnej dlhej osi Zelená: Ručné krúženie endokardom a meranie dĺžky srdca v diastole Toto nastavenie sme navyše použili na výpočet hmotnosti srdca ľavej komory podľa metódy plošnej dĺžky, čo vedie k najlepším výsledkom u ľudí a myší (Collins a kol., 2001; Devereux a kol., 1986). Dĺžka ľavej komory sa meria od vrcholu endokardu po mitrálny prstenec a na úrovni papilárneho svalu sa vytvára M-režim (Collins et al., 2001). S nasledujúcim druhým nastavením, krátkou osou, sme uložili 3 rôzne roviny rezu v režime B v oblastiach vrcholu, stredu a základne. Za týmto účelom bol endokard ručne krúžený vo všetkých troch rezných rovinách v systole a diastole. Obrázok 2.18: Krátka os v režime B (ľavá komora) Čierna v strede = lumen srdca, okolo nej svetlošedá = endokard, tmavošedá = myokard 56 Pravá komora

Materiál a metódy 2.11 Štatistické vyhodnotenie Údaje všetkých experimentov sa uvádzajú ako stredné hodnoty (MW) ± štandardná odchýlka (SD) a pochádzajú od mnohých myší (n) vysvetlených v každom experimente. V závislosti na tom, čo bolo pre otázku vhodné, sa štatistická významnosť počítala s nepárovým t-testom, jednosmernou ANOVA alebo lineárnou regresiou. S p-hodnotou