Lokalizácia, identifikácia a excízia protokolu o skladoch tukových myší (preložené do nemčiny)
Zhrnutie
Kvôli drastickému a negatívnemu spojeniu medzi obezitou a inými komorbiditami je oprávnený výskum úlohy, ktorú má tukové tkanivo pri chorobe a celkovom zdraví. Poskytujeme protokol na izoláciu a odstránenie zásob tukových tkanív, ktorý umožňuje štúdium tukového tkaniva pomocou metód in situ a in vitro.
Úvod
Obézny sa v centre pozornosti médií objavil pozoruhodne kvôli dramatickému nárastu obezity v posledných desaťročiach 20. storočia. Obezita v súčasnosti postihuje viac ako tretinu dospelých a 17% detí a dospievajúcich v USA (USA) 1. Štatistické výskumy okolo epidémie obezity naprieč všetkými etnikami preukázali, že nehispánski černosi majú najvyššia miera obezity upravená podľa veku (49,5%) v porovnaní s Američanmi Mexičana (40,4%) všetkých Hispáncov (39,1%) a nehispánskych belochov (34,3%) 2. Ekonomický dopad obezity je tiež rastúci záujem o systém zdravotníctva. V roku 2012 sa odhadovalo, že ročné náklady na starostlivosť o obezitu v USA v roku 2005 predstavovali 190,2 miliárd dolárov, čo je takmer 21% z celkového rozpočtu na lekárske výdavky. Bohužiaľ sa odhaduje, že detská obezita je zodpovedná iba za 14 miliárd dolárov iba z priamych lekárskych nákladov. Štatisticky sa zistilo, že priemerné náklady na zdravotnú starostlivosť u tých, ktorí mali nadváhu, boli o 2 741 dolárov ročne vyššie ako u tých, ktorí nemali túto 3–5 chorobnosť.
Obezita je dôležitým rizikovým faktorom pre rôzne choroby, ako sú: cukrovka 2. typu, poruchy metabolizmu lipidov, kardiovaskulárne choroby, rakovina, poruchy pohybového aparátu a chronické zápaly. Obezita úzko súvisí s patogenézou metabolického syndrómu a iných chronických ochorení 6-8. Vďaka takým drastickým a negatívnym vzťahom medzi obezitou a inými komorbiditami zameral vedecký výskum pozornosť na súčasnú epidémiu a rozmanitú a rozhodujúcu úlohu, ktorú tukové tkanivo hrá pre lepšie pochopenie.
Historicky sa tukové tkanivo považovalo za bezvýznamné a považovalo sa za iba jednoduché výplňové tkanivo. V súčasnosti sa ukázalo, že tukové tkanivo hrá vo funkcii tela veľa dôležitých úloh: metabolizmus, hormonálna rovnováha, zápal, ochrana a izolácia 9. Tukové tkanivo je primárne tvorené z adipocytov, ale obsahuje aj pericyty, endotelové bunky, monocyty, makrofágy a pluripotentné kmeňové bunky 8. Tukové tkanivo je tvorené adipocytmi distribuované cez telo v rôznych depách. Hlavné depoty sa nachádzajú subdermálne, subkutánne, intramuskulárne a viscerálne 10. Ukázalo sa, že depoty tukov majú depotné profily špecifických látok, ktoré vykazujú depotnú špecifickú citlivosť na obezitu a súvisiace poruchy 8.
Tukové tkanivo sa tradične klasifikovalo do dvoch hlavných typov: biele tukové tkanivo (WAT) a hnedé tukové tkanivo (BAT); aj keď nedávna literatúra ukazuje na prítomnosť tretej skupiny pokrsteného britového alebo béžového tukového tkaniva 11. Ukázalo sa, že tukové tkanivo má rôzne farby súvisiace s morfológiou, metabolickými funkciami, biochemickými vlastnosťami a vzormi genetickej expresie 10. Adipocyty vo WAT sú jedna veľká kvapka tuku a premenlivé množstvo mitochondrií. WATdominant nájdený v subkutánnych a viscerálnych lokalitách tela. WAT funguje primárne ako miesto skladovania energie a ochrany orgánov. Adipocyty v BAT majú multilokulárnu morfológiu a bohaté mitochondrie. BAT sa primárne nachádza v krku a veľkých krvných cievach hrudníka, ako aj v 12 lopatkách. BAT funguje primárne v energeticky náročnom správaní, ktoré reguluje termogenézu 7. Ukázalo sa, že britské alebo béžové tukové tkanivo majú analogickú morfológiu a expresiu BAT, ale zistilo sa, že pochádzajú z bielych tukových buniek 11.
Cieľom protokolu je poskytnúť presnú metódu identifikácie a izolácie rôznych typov tukových usadenín z viacerých anatomických miest.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Protokol
POZNÁMKA: Všetky testy na zvieratách sa uskutočňovali so súhlasom Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť a použitie zvierat (IACUC) na univerzite v Cincinnati a v súlade s Sprievodcom národnými inštitútmi zdravia pri starostlivosti a používaní laboratórnych zvierat (publikácia NIH 85-23), Revidované 1996).
1. Myš usmrtte a sterilizujte
- Umiestnite myš do schránky vyrobenej zo supratheraputickej dávky izofluránu a nechajte prostriedok vdýchnuť. Po zabití myši ju vyberte z poľa.
- Posun krčka maternice ako druhý prostriedok eutanázie.
- Sterilizujte vonkajší povrch myši vyčistením zvieraťa 70% etanolom.
2. Identifikácia a izolácia troch rôznych skladov tukového tkaniva
3. Izolácia perivaskulárneho tukového tkaniva (PVAt)
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.
Reprezentatívne výsledky
Identifikácia a lokalizácia inguinálneho podkožného tukového tkaniva, medzilopatkového hnedého tukového tkaniva, viscerálneho tukového tkaniva nadsemenníka (Obrázok 1) rovnako ako aortálny oblúk, perivaskulárne tukové tkanivo, hrudné aortálne tukové tkanivo, susedné tukové tkanivo aorty a infrarenálne tukové tkanivo (Obrázok 2) bola úspešne dosiahnutá opísanou chirurgickou metódou. Histologické vyšetrenie a diferenciácia medzi vzorkami BAT a WAT boli pozitívne pri farbení hematoxylínom a eozínom (H&E) (Obrázok 3) hodnotené. Analýza RNA adiponektínu (ADIPOQ), peroxizómového proliferátora aktivovaného receptora gama (PPAR-y), efektora a indukujúceho bunkovú smrť DFFA (CIDEA) a ďalších markerov špecifických pre tuk sa merala pre všetky vyššie uvedené izolované a vystrihnuté sklady (údaje nie sú uvedené).
Primárne bunkové línie zo subkutánnych tukových buniek a perivaskulárnych adipocytov sa kultivovali a diferencovali z preadipocytov na adipocyty úspešne na mikromaticovú analýzu. Kultivované preadipocyty sa konvertovali na adipocyty olejovým červeným O farbením (Obrázok 4) schválené. Bola dosiahnutá úspešná izolácia, kultivácia a diferenciácia tukových buniek na použitie v štúdiách in vitro a bola úspešne zmeraná aktivita proteínov. Enzymatická aktivita matrixovej metaloproteázy-2 (MMP-2) sa merala v liečenej skupine v porovnaní s kontrolou. Aktivita MMP-2 sa stanovovala in situ v primárnej perivaskulárnej adipocytovej línii pomocou zymografie (Obrázok 5) merané.
Diskusia
Obezita môže viesť k širokej škále komorbidít a nie je úplne pochopené úplné pochopenie úlohy, ktorú obezita hrá; preto je nevyhnutný ďalší výskum v oblasti obezity. Zvieracie modely, najmä myšie modely, sú ideálne na predbežný výskum progresie ochorenia a testovanie potenciálnych farmaceutických postupov. Pri použití týchto modelov je presná separácia a odstránenie usadenín tukového tkaniva mimoriadne dôležitým a nevyhnutným nástrojom pri štúdiu patológie tukového tkaniva ovplyvňujúcej choroby.
V súčasnej literatúre o obéznych ložiskách existuje značné množstvo literatúry o metabolickom správaní a rozdieloch medzi obéznymi ložiskami a ich anatomickými polohami. Existuje však len málo z nich, ktoré ponúkajú dôkladnú metódu, ako tieto sklady konkrétne vyhľadať, identifikovať a izolovať. Na základe preskúmania súčasných postupov izolácie z tukového tkaniva existuje malá podmnožina protokolov tcap, ktoré poskytujú metodiku izolácie jedného alebo dvoch skladov súčasne. Avšak presnou technikou, ktorá umožňuje izoláciu viacerých skladov s minimálnym množstvom prípravy a kontaminácie a rovnako sa zameriava na rôzne metódy vyšetrovania odobratých vzoriek, je tento protokol 13-14.
V rámci tejto metódy existuje niekoľko krokov, ktoré sú rozhodujúce pre izoláciu a čistotu vzorky. Čistenie nástrojov, rukavíc a povrchov často na odstránenie chĺpkov a nečistôt je nevyhnutným krokom k zabráneniu depotnej kontaminácie. Pri prerezávaní kože po obvode myši, aby sa obnažilo pobrušnice na odskrutkovanie, je dôležité nenechať nič príliš hlboké. Rezaním pobrušnice bude odlievanie veľmi ťažké a zvýši sa možnosť kontaminácie vzorky. Pri vyrezávaní zásobníka tukového tkaniva SQ je dôležité určiť trojuholníkové hranice zásobníka pred vyrezaním niektorého z tukov. Opatrne by ste mali tiež rezať, aby ste zabránili vzniku svalov a susedných ciev, žliaz a tukového tkaniva. Tým sa zabráni kontaminácii vzorky z alternatívneho tukového tkaniva, žľazového tkaniva, svalov alebo krvi.
Hlavné obmedzenie izolácie a vyrezania zásob tukových tkanív v tomto postupe a ďalších porovnateľných postupov možno nájsť vo vymedzení hraníc určitých zásob. Kvôli zle definovaným hraniciam v zásobách, napríklad v podkožných zásobách, môže byť izolácia malého množstva nečistôt zo susedného tukového tkaniva zložitá. Ďalšie obmedzenie možno nájsť v zaistení dostatočného množstva tkaniva vo vaskulárne spojených depách na doplňujúce pokusy. Toto obmedzenie niekedy vyžaduje zhromaždenie vzoriek, aj keď v závislosti od miesta izolácie a stravy súvisiacej so zvieraťom.
Po izolácii zásob tukových tkanív sa môžu použiť na rôzne testy. Tukové tkanivo sa môže použiť na molekulárne štúdie, ako je napríklad expresia proteínu, aktivita enzýmu a analýza génovej expresie. Okrem toho môže adipocyt izolovať primárnu bunkovú líniu in vitro. Imortalizované bunkové línie sa môžu tiež použiť na in vitro štúdie, avšak nesmrteľné bunky nie sú také dôveryhodné ako primárne samostatné bunkové línie. Nakoniec môže byť tukové tkanivo pevné alebo zmrazené v OCT na histologické vyšetrenie na identifikáciu infiltrácie leukocytov, lokalizácie proteínov a charakterizácie morfológie adipocytov.
Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.