Mimetiká Smac indukujú nekrotický zápal a smrť nádorových buniek moduláciou
predmetov
abstraktné
Makrofágy sú plastové bunky, ktoré sa vyznačujú rôznymi aktivačnými stavmi. 23 Klasicky aktivované makrofágy (M1) a alternatívne aktivované makrofágy (M2) predstavujú dva extrémy v spektre makrofágového fenotypu.Makrofágy spojené s nádorom sú klasifikované ako makrofágy M2 na základe ich profilu expresie cytokínov; Produkujú vysoké hladiny imunosupresívnych cytokínov, ako je interleukín-10 (IL-10), a väčšinou v solídnych nádoroch zdieľajú niektoré funkcie opravy tkanív s fibroblastmi. 23, 25 Naproti tomu makrofágy M1 produkujú veľké množstvo prozápalových cytokínov, vrátane interferónu-y. (IFN y) a IL-12 a môžu sa podieľať na vyvolaní účinnej protinádorovej imunitnej odpovede. Plastickosť makrofágov naznačuje nové terapeutické prístupy zamerané na zvrátenie fenotypu M2 26, najmä u nádorov, v ktorých hrá zásadnú úlohu infiltrácia makrofágov, ako je karcinóm vaječníkov. V súlade s tým boli v modeli myších ovariálnych ascitov generované makrofágy moduláciou NF-a. Signalizácia B preprogramovaná. 27
Nedávno sme opísali syntézu nových dimérnych molekúl zameraných na XIAP, cIAP1 a cIAP2. 28, 29 Jedna z týchto molekúl, SM83, inhibovala rast SM-senzitívneho ľudského prsného adenokarcinómu MDA-MB231 a rabdomyosarkómu Kym-1, ale nie iných bunkových línií. Tu používame dva myšie modely xenoimplantátov rakovinových ascitov, aby sme ukázali, že SM83, keď sa podáva v monoterapii, zvyšuje prežitie týchto myší zameraním na makrofágy spojené s nádorom. Pomocou TNF SM83 rýchlo indukuje nekrózu intraperitoneálne (ip) injikovaných rakovinových buniek, ktoré sú in vitro úplne rezistentné na protinádorové účinky SM83. Naša práca ukazuje, že SM83 má rôzne mechanizmy účinku in vitro a in vivo a že svoju protinádorovú aktivitu uplatňuje in vivo stimuláciou imunitného systému.
Výsledky
SM83 senzibilizuje bunkovú líniu karcinómu vaječníkov IGROV-1 na apoptotické účinky TRAILU
SM83 indukuje apoptózu in vitro v kombinácii s TRAIL. ( a ) Chemická štruktúra dimérneho SM SM83. ( ) IGROV-1 bunky dostali 0, 1 alebo 1, 0 u M SM83 liečený samotný alebo v kombinácii s 2 alebo 10 ng/ml TRAIL. Rast buniek sa vyjadruje ako percento v pomere k simulovane upraveným bunkám vehikulom. Hodnoty sú priemerom a SD z experimentu, ktorý je reprezentatívnym experimentom troch uskutočnených experimentov. ( c a d ) Western blot analýza XIAP, cIAP1, cIAP2 a štiepeného PARP (Cl PARP) v bunkách IGROV-1, ktoré boli ošetrené SM83 ( c ) alebo SM59 (SM-164) ( d ) Ošetrené v neprítomnosti alebo v prítomnosti 10 ng/ml TRAIL. Aktín sa zobrazuje ako kontrola nabitia. Šípka, špecifická páska XIAP
Monoterapia SM zvyšuje prežitie myší s rakovinovým ascitom
SM83 a SM59 sa potom testovali in vivo s použitím myšieho modelu xenoimplantátu, v ktorom sa IGROV-1 bunky injikovali ip do atymických nahých myší, čo viedlo k ascitu a smrti. Liečba SM83 (2a) a SM59 (2b) zvýšila prežitie myší (P.
Liečba SM83 v monoterapii zvyšuje prežitie myší s rakovinovým ascitom. ( a ) Do nahých myší sa injekčne podali bunky IGROV-1 a neliečili sa (O) alebo sa ošetrovali 5-krát týždenne počas 2 po sebe nasledujúcich týždňov odo dňa po injekcii 5 mg/kg SM83 (1), 2,5 mg/kg TRAIL ( ∇) alebo s rovnakou dávkou SM83 a TRAIL spolu (▪). Je zobrazený experiment predstavujúci dve uskutočnené. Každá liečená skupina obsahovala sedem myší. Krivka prežitia pre myši a kontroly ošetrené SM83. ( ) Krivka prežitia pre myši ošetrené SM59 a kontrolné myši. Neošetrené (○) alebo ošetrené SM SM59 (∇). ( c Tvorba ascitu sa kontrolovala monitorovaním telesnej hmotnosti 17. deň. ( d a e ) Bunky Meth A sa injikovali myšiam BALB/c a ošetrovali sa 5 mg/kg SM83 denne od 7. dňa. ( d Tvorba ascitu sa kontrolovala monitorovaním telesnej hmotnosti v deň 13. Vodorovná čiara predstavuje priemer. ( e ) Krivka prežitia u neošetrených () alebo liečených SM83 () myšami od 7. dňa
Na testovanie toho, či in vivo aktivita SM83 bola špecifická pre bunkovú líniu alebo obmedzená na imunodeficientné myši, sme použili iný model ascitu, v ktorom sa myším sarkómovým bunkám MethA injikovali ip imunokompetentné syngénne myši BALB/c. Podobne ako bunky IGROV-1, ani bunky Meth A neboli inhibované rastom SM83 in vitro (údaje nie sú uvedené). U myší SM83 znižoval progresiu ascitu, čo sa považovalo za mierne zvýšenie telesnej hmotnosti (2d), a zvýšil priemerný čas prežitia z 15 dní pre neošetrené zvieratá na 26 dní (P = 0,0721; 2e). Aj v tomto modeli nebola kombinácia s TRAIL výhodná (údaje nie sú uvedené). Keď sa myšiam liečeným pomocou SM83 (4 zo 14 testovaných myší) podala nová injekcia 4 x 105 buniek Meth A (dvakrát toľko ako pri prvom podaní), nedošlo k žiadnemu novému ascitu (údaje nie sú zobrazené). Tieto výsledky naznačujú, že u týchto zvierat sa vyvinula adaptívna imunita.
SM83 rýchlo zabíja rakovinové bunky plávajúce v ascite prostredníctvom apoptotického mechanizmu
Na štúdium mechanizmu aktivity SM83 in vivo sa z myší, ktorým sa injikovali bunky IGROV-1, ošetrila ascitická tekutina a ošetrovali sa s SM83 3, 6 alebo 24 hodín a spočítali sa nádorové bunky. Výsledky ukázali pozoruhodný pokles (P.
Aby sme pochopili mechanizmus bunkovej smrti zodpovedný za zníženie počtu plávajúcich nádorových buniek v ascite, skúmali sme expresiu mediátorov apoptózy v týchto bunkách v rôznych časových bodoch. Po 24 hodinách malo ošetrenie SM83 za následok iba mierne zvýšenie štiepenej PARP, žiadny dôkaz štiepenej aktívnej kaspázy-8 (čo sa očakávalo, pretože tieto bunky sú usmrcované SM monoterapiou in vivo) a iba malý účinok na štiepení kaspázy -3 (obrázok 3d). Na rozdiel od toho bunky ošetrené TRAIL vykazovali väčšiu aktiváciu týchto apoptotických markerov, aj keď TRAIL bol neúčinný pri znižovaní počtu buniek ascitu (doplnkový obrázok S1). V pokuse o detekciu apoptotických udalostí sa uskutočnilo Western blotovanie na bunkách zhromaždených po 3 a 6 hodinách liečby (3e). Aj v tomto prípade SM83 spôsobil úplnú degradáciu cIAP1 a cIAP2, ale došlo iba k slabej akumulácii štiepených foriem PARP, kaspázy-8 a kaspázy-3. Táto nízka aktivácia apoptotickej kaskády naznačuje, že príčina smrti nádorových buniek ascitu nebola primárne apoptotická.
Na vyhodnotenie možnosti, že autofágia - ďalší mechanizmus, ktorý môže viesť k bunkovej smrti, keď je abnormálne a nepretržite aktivovaná - je zodpovedná za úbytok nádorových buniek ascitu, sme zmerali hladiny Beclin-1 a štiepili LC3B. Liečba SM83 nezvýšila hladiny týchto proteínov (doplnkový obrázok S2), čo naznačuje, že autofágia sa nepodieľa na smrti nádorových buniek indukovanej SM83.
SM83 spúšťa zápalovú udalosť in vivo
Liečba SM83 indukuje expresiu zápalových cytokínov in vivo. Do nahých myší sa ip injikovali bunky IGROV-1 a pôsobilo sa na ne jednou dávkou 5 mg/kg SM83 alebo nie; Ascites sa zhromaždil 3, 6 a 24 hodín po podaní SM83. ( a ) SM83 dočasne zvýšila hladinu TNF u myší meranú pomocou ELISA. ( ) Liečba SM83 znížila počet buniek ascitu, ale tento účinok bol blokovaný, keď sa TNF izoloval s vyššou dávkou etanerceptu (P = 0,0118 v porovnaní s liečbou samotným SM83). ( c ) Western bloty proteínu nádorových buniek ascitu od neošetrených myší a myší liečených SM83 samotným alebo v kombinácii so 150 mg/kg etanerceptu. Šípka, konkrétna stuha pre XIAP. ( d - H ) Výsledky ELISA pre IL-1? ( d ), IFN-? ( e ), IL-10 ( f ), transformujúci rastový faktor & bgr; (TGF-?) ( G ) a IL-4 ( H ) v tekutine ascitu z myší liečených ako je uvedené vyššie. Výsledky pre IL-10 sú uvedené ako násobná indukcia v dôsledku nedostatku štandardu rekombinantného proteínu
SM83 podporuje aktiváciu makrofágov smerom k fenotypu podobnému M1
Liečba SM aktivuje makrofágy a senzibilizuje ich na nekrotickú smrť. ( a a ) BALB/c BMDM (5 x 105) sa naočkovali na 96-jamkové doštičky, nechali sa priľnúť 16 hodín a injikovali sa 1 μl až 24 hodín. M SM83 ošetrené alebo nie. Liečba SM83 podporovala sekréciu prozápalových cytokínov TNF ( a ) a IL-1β ( ). ( c ) NF-? B aktivácia pomocou SM83 hodnotená v makrofágovej bunkovej línii RAW stabilne transfekovanej NF-a Reportérový gén B-luciferázy. Je znázornený reprezentatívny experiment dvoch uskutočnených. Hodnoty sú priemerné a SD; n = 3. ( d a e ) BALB/c BMDM sa naočkovali na šesťjamkové doštičky, nechali sa priľnúť 16 hodín a pôsobilo sa na ne sériové riedenie SM83 v neprítomnosti alebo v prítomnosti nekrostatínu-1 alebo z-vad-fmk, aby sa inhibovala nekroptóza alebo apoptóza. ( d) Reprezentatívne obrázky ukazujúce morfológiu buniek po 24 hodinách liečby. ( e ) Životaschopnosť buniek po ošetrení hodnotených pomocou testu CellTiter-Glo
Vylúčiť možnosť, že IL-1 indukovaný SM83? Sekrécia je dôsledkom kontaminácie lipopolysacharidmi (LPS), pripravili sme BMDM z myší TLR4 knockout (KO) a zistili sme, že IL-1? sa vylučoval v podobnom rozsahu ako sa vylučoval z buniek BALB/c (doplnkový obrázok S4). Ďalej sa zistilo, že injekčné prípravky SM83 neobsahovali detekovateľné množstvo LPS v teste Endosafe PTS (Charles River Laboratories, Calco, Taliansko) (údaje nie sú uvedené). Tieto výsledky naznačujú, že SM83-indukovaný IL-1? -Výroba nebola spôsobená kontamináciou LPS.
Okoloidúca akumulácia neutrofilov v ascite
Neutrofily sa potom izolovali zo slezín myší s nedostatkom BALB/c (divokého typu) a TNF receptora 1 (TNF-R1), aby sa zistila úloha neutrofilov v protinádorovej aktivite SM83 in vitro. V testoch Transwell bola migrácia neutrofilov divokého typu na ascites z myší liečených SM83 vyššia ako z neošetrených myší (6d). Inhibítor HMGB-1 čiastočne znižoval migráciu, zatiaľ čo neutrofily z myší s deficitom TNF-R1 nemigrovali v reakcii na ascites z myší liečených SM83. Ascites z myší liečených SM83-aktivovanými neutrofilmi divokého typu na produkciu superoxidu aj v prítomnosti blokátora TNF etanerceptu, zatiaľ čo glycyrizín túto aktivitu úplne blokoval (6e). Tieto výsledky naznačujú, že migrácia neutrofilov v prítomnosti ascitu z myší ošetrených SM83 je stimulovaná TNF, zatiaľ čo aktivácia je spôsobená HMGB-1. Dôležitosť TNF pre migráciu neutrofilov sa tiež preukázala in vivo, keď predbežná liečba etanerceptom blokovala nábor týchto buniek do ascitu (doplnkový obrázok S5).
Stručne povedané, naša práca ukazuje, že SM83 účinkuje in vivo v rakovinovom ascite reverziou makrofágov z fenotypu podobného M2, ktorý podporuje nádor, na fenotyp podobný M1, ktorý je vybavený protinádorovou aktivitou. Makrofágy M1 vylučujú cytokíny, ako je TNF, IL-1? a IFN? spôsobujúce rýchlu od TNF závislú nekrotickú smrť rakovinových buniek ascitu (7); Umierajúce bunky potom uvoľňujú HMGB-1, ktorý spolu s TNF stimuluje masívnu infiltráciu neutrofilov.
Navrhovaný mechanizmus účinku SM83 na rakovinové ascity. SM83 stimuluje reverziu makrofágov z M2 na M1 fenotyp. TNF vylučovaný makrofágmi M1 spúšťa nekrotickú smrť rakovinových buniek v tekutine ascitu; Umierajúce bunky uvoľňujú HMGB-1, ktorý spolu s TNF zhromažďuje neutrofily
diskusia
V tejto štúdii popisujeme in vivo aktivitu novo syntetizovaného SM SM83 v dvoch xenoimplantátových modeloch pre rakovinový ascites u myší. Ukazujeme, že SM83 je účinný ako monoterapia in vivo na ľudských a myších rakovinových bunkách, ktoré sú rezistentné na SM in vitro, a dokazujeme, že tieto bunky hynú apoptotickým mechanizmom nezávislým od TNF. Poskytujeme tiež dôkaz, že SM83 vykonáva svoju prácu spúšťaním zápalu a aktivácie imunitných buniek, čo vedie k imunogénnej smrti rakovinových buniek. Naša štúdia navyše ukazuje, že aktivita SM83 (a možno aj ďalších SM) v komplexnom prostredí in vivo sa líši od aktivity už pozorovanej in vitro.
V mikroprostredí nádoru, vrátane rakoviny vaječníkov, získavajú makrofágy fenotyp podobný M2. 38, 39 Napriek tomu niektorí autori navrhli rôzne stratégie 23, 24, ktoré môžu meniť stav makrofágov v smere účinnej protinádorovej odpovede. V tejto súvislosti sa tiež ukázala možnosť zvýšenia účinnosti štandardných terapií, ktoré narúšajú M2 makrofágy, 40 najmä u nádorov, ktorých progresia závisí výlučne od ich podpory, ako je napríklad karcinóm vaječníkov. Tieto nádory vytvárajú komplexný vzťah s asociovanými imunitnými bunkami v ascite 41 a rozvíjajú imunosupresívne mikroprostredie produkované makrofágmi. Preto pri rakovine vaječníkov môže byť repolarizácia makrofágov alebo inhibícia ich náboru novou účinnou terapeutickou stratégiou.
Naše výsledky naznačujú, že SM regulujú imunitnú reakciu na rakovinové ascity polarizáciou makrofágov a majú tak terapeutický potenciál. V skutočnosti Smac/DIABLO 42 a tu zobrazené mimetické SM83 spúšťajú nekrotickú alebo nekrotickú bunkovú smrť. Nekrotické bunky, iné ako apoptotické, uvoľňujú neoxidovanú imunogénnu formu alarmínu HMGB-1 43, ktorá aktivuje dendritické bunky aktiváciou receptorov pre konečné produkty koncovej glykácie, TLR4, TLR7 a TLR9 receptory. 44 Okrem toho môžu nekrotické bunky trénovať CD4 + T bunky, ktoré sú nevyhnutné pre vývoj adaptívnej imunitnej odpovede. 45 Možnosť, že adaptívna imunitná odpoveď je vyvolaná nekrózou vyvolanou SM83, je zvýšená našimi výsledkami pri použití imunokompetentných myší BALB/c s ascitmi meth-A. Niektoré z týchto myší boli vyliečené ošetrením SM83 a nevyvinuli sa pri nich ďalšie ascity, keď boli vystavené novej dvojnásobnej dávke buniek Meth A, čo naznačuje, že boli imúnne voči bunkám Meth A sarkómu.
V súhrne naše údaje ukazujú, že SM83 je aktívny v monoterapii podporou zápalu a smrti imunogénnych buniek. Tieto pozorovania poskytujú vysvetlenie, prečo SM zvyšuje účinnosť štandardných terapií stimuláciou imunitného systému. Nakoniec dôkazy o tom, že SM môže vyvolať zápalovú reakciu a aktivovať imunitný systém, poskytujú interpretáciu toho, prečo môže byť SM účinnejší in vivo ako in vitro, 11, 46, a naše výsledky pri zabíjaní rakovinových buniek.