Mitochondriálne cytopatie - PDF na stiahnutie zadarmo

Mitochondriálne cytopatie Spracovanie odlišnej patogenézy vybraných mitochondriálnych cytopatií na základe dvoch prípadových štúdií Christiana Haverkampa

zadarmo

Mitochondriálne cytopatie Spracovanie rozdielnej patogenézy vybraných mitochondriálnych cytopatií na základe dvoch prípadových štúdií Dizertačná práca schválená Lekárskou fakultou Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen na získanie akademického titulu doktora medicíny od Larsa Christiana Arndta Simona Haverkampa z Duisburg Reporter: Herr Universität rer. nat. Gerhard Buse pán univerzitný profesor Dr. med. J. Michael Schröder Deň ústnej skúšky: 13. júna 2008 Táto dizertačná práca je k dispozícii online na webovej stránke univerzitnej knižnice

Obsah 1 Úvod. 4 1,1 Mitochondrie. 4 1.1.1 Oxidačná fosforylácia (OXPHOS). 4 1.1.2 Reaktívne formy kyslíka. 5 1.1.3 Apoptóza. 5 1.2 Štruktúra a organizácia mitochondriálnej DNA (mtdna). 6 1.3 Primárne mitochondriálne ochorenie. 8 1.3.1 Bodové mutácie mtdna. 8 1.3.2 Vymazanie mtdna. 11 1.4 Sekundárne mitochondropatie. 11 1.5 Primárna kardiomyopatia. 12 1.5.1 Poruchy jadrového génu. 12 1.5.2 Poruchy mitochondriálnych génov. 15 2 Cieľ práce. 19 3 Materiál a metódy. 20 3.1 Pôvod vzoriek tkaniva. 20 3.1.1 Ovládacie prvky. 3.1.1 Pacient p1/p2. 20 3.1.3 Pacient p3. 21 3.1.4 Pacient p4. 21 3.2 Príprava mitochondriálnej DNA. 25 3.2.1 Izolácia mtdna z krvi. 25 3.2.2 Izolácia mtdna zo svalového tkaniva. 26 3.2.3 Organická lýza. 27 3.2.4 Extrakcia fenolom/chloroformom. 27 3.3 Gélová elektroforéza. 27

3.3.1 Elektroforéza na agarózovom géle. 27 3.3.2 Elektroforéza na akrylamidovom géli. 28 3.4 PCR. 30 3.4.1 Konvenčná PCR. 30 3.4.2 Diaľkové -PCR (LPCR). 32 3.5 Postupnosť. 33 3.5.1 Purifikácia DNA. 34 3.5.2 Sekvenčná reakcia. 34 3.5.3 Príprava vzoriek na automatické meranie. 34 3.5.4 Vyhodnotenie merania. 35 3.6 Polymorfizmus s obmedzenou dĺžkou fragmentu (RFLP). 35 3.6.1 MERRF: Ban-II A8344G. 35 3.6.2 MELAS: Apa-1 A3243G. 35 3.6.3 LEIGHT: Msp-I T8993C/G. 36 3.6.4 LHON: SfaN-I 11778A/Mae-III 11778A. 36 3.7 Roztoky a pufre. 37 4 výsledky. 40 4,1 LHON. 40 4.1.1 Príprava. 40 4.1.2 PCR. 40 4.1.3 Reštrikčná analýza. 40 4.2 Kardiomyopatie. 42 4.2.1 Príprava mikrosvalov. 42 4.2.2 Príprava. 43 4.2.3 Skríning delécie LPCR. 43 4.2.4 Postupnosť. 45 5 Diskusia. 47 5,1 LHON. 47

5.1.1 Patogenéza. 47 5.1.2 Cytostatická terapia. 51 5.1.3 Literatúra a záverečné hodnotenie. 54 5.2 Kardiomyopatia. 56 5.2.1 Medzigenomická komunikácia. 56 5.2.2 Dôležitosť nájdených zmien. 65 5.2.3 Zhrnutie. 67 6 Adresáre. 69 6.1 Zoznam tabuliek. 69 6.2 Zoznam obrázkov. 69 6.3 Zoznam skratiek. 70 6.4 Bibliografia. 73

1.1 Mitochondria Kondenzácia chromatínu a rozklad chromatínu, na ktorom sa podieľa aj CAD. Zdá sa, že otvorenie prechodového póru mitochondriálnej permeability (mtptp) vedie ku kolapsu elektrochemického gradientu, k opuchu vnútornej membrány a k prasknutiu vonkajšej membrány. Zdá sa, že mtptp sa skladá z andenozínového nukleotidového translokátora (ANT), porínu a ďalších faktorov, ako sú Bax (X proteín asociovaný s BCL2), Bcl2 (leukémia/lymfóm b-buniek 2), cyklofilín D a benzodiazepínový receptor. Otvorenie je pravdepodobne spôsobené zvýšenou expozíciou ROS, poklesom Ψ alebo nadmerným príjmom vápnika. 2-9 Obrázok 1: Dôležité metabolické cesty v mitochondrii 1.2 Štruktúra a organizácia mitochondriálnej DNA (mtdna) Mitochondrie sú pod kontrolou dvoch genómov. Väčšina mitochondriálnych štruktúrnych a funkčných proteínov je kódovaná jadrom, preložená do cytosolu a transportovaná do mitochondrií prostredníctvom rozpoznávacej sekvencie. 13 proteínových podjednotiek, 22 trn a 2 RNA je kódovaných mitochondriálnym genómom. Proteíny sú výhradne súčasťou dýchacieho reťazca: cytochróm b, podjednotky 1, 2 a 3 cytochróm c oxidázy, šiesty

1.2 Štruktúra a organizácia mitochondriálnej DNA (mtdna) Obrázok 2: Mitochondriálny genóm a charakteristické mutácie 1.3 Primárne mitochondropatie 1.3.1 Bodové mutácie mtdna 1.3.1.1 Leberova dedičná optická neuropatia (LHON) LHON vedie akútne k subakútnej slepote prostredníctvom straty centrálneho zorného poľa. Postihuje hlavne mužov v strednom veku. V súčasnosti je známych 18 mutácií v mitochondriálnej DNA, ktoré spôsobujú ochorenie samotné alebo v kombinácii. 1.3.1.1.1 Klinické príznaky Príznaky sa zvyčajne začínajú v strednom veku akútnou až subakútnou bezbolestnou stratou centrálneho zorného poľa. Fundoskopicky 8

3,6 g tkaniva, ktoré sa rozdelí na časti po približne 100 mg. S touto časťou sa potom zaobchádza ako s mikropreparátom 26, jednotlivcom

3.2 Príprava mitochondriálnej DNA Mitochondriálne pelety sa zhromaždia. Prípravok maxi sa používa na získanie kontrolných šablón. Materiál pre pacientov je na objednávku

3.4 PCR priame a reverzné primery (MWG Biotech) a 1350 ul Aqua sterilné. Podmienky PCR pre jednotlivé fragmenty sú uvedené v tabuľkách 5 a 6. Podmienky PCR sa líšia pre príslušné fragmenty, pokiaľ ide o teplotu žíhania, čas predĺženia a počet cyklov. Teplota v stupňoch Celzia Čas v sekundách Prvá denaturácia 94 300 Denaturácia 94 30 Žíhanie Tann 60 Rozšírenie 72 Textová tabuľka 5: Základný profil PCR 31

3.6 Polymorfizmus s dĺžkou reštrikčných fragmentov (RFLP) 3.6.3 LEIGH: Msp-I T8993C/G LEIGH mutácia T8993C a T8993G sa deteguje pomocou RFLP analýzy fragmentu 7. Reštrikčný profil Msp-I (Gibco BRL) s C ^ CGG štiepiacim miestom pre tento fragment je znázornený na obr. MELAS: A3243G divoký typ MERRF: A8344G mutácia divoký typ 3001 Leigh: mutácia T8993C/G divoký typ 7415 mutácia 8363 246bp 3247 1431bp 839bp 839bp 629/630bp 842bp 1185bp 41bp 8254 41bp 8295 4432 68b2 9205 Obrázok 3: Schematické znázornenie reštrikčného vzoru 3.6.4 LHON: SfaN-I 11778A/Mae-III 11778A Pre RFLP analýzu mutácie LHON 11778 sú k dispozícii dva rôzne testy. Výsledkom mutácie LHON je eliminácia jedného štiepneho miesta pre reštrikciu F10 pomocou SfaN-I a nového štiepneho miesta pre reštrikciu Mae III. Použitie obidvoch testovacích metód znižuje riziko falošne negatívnych alebo falošne pozitívnych výsledkov. 36

3.6 Polymorfizmus reštrikčných fragmentov dĺžky (RFLP) SfaN I: GATGC 11450 997 122 12570 122 12570 LHON 11450 318 679 Divoký typ Obrázok 4: Reštrikčný obrazec LHON 11778 s obmedzeniami SfaN I Mae III: 11450 200 ^ GTNAC 125 130 58 607 12570 60750 12570 LHON 255 58 divoký typ Obrázok 5: Reštrikčný profil LHON 11778 s roztokmi MAE III 3.7 a pufrom Fragmentovo špecifická hlavná zmes (PCR) 5,55% priamy primér (8 pmol/100 ul) 5,55% reverzný primer (8 pmol/100 ul) 1,11% polymerizácia - Zmiešajte 11,11% 10-násobne Taq pufor 76,66% aqua sterilný hemolýzny pufor 37

3.7 Roztoky a pufre 10 mm NH4HCO3 144 mm NH4Cl H pufor 210 mm manitol 70 mm sacharóza 1 mm EDTA 5 mm HEPES (1 M roztok) 0,5% albumínový tlmivý roztok (agarózové gély) 15% Ficoll 50 mm EDTA 0,5% SDS 1x TBE 0,1% (hmotn./hmotn.) Brómfenolová modrá 0,1% (hmotn./hmotn.) Plniaci xylén-kyanolový tlmivý roztok (polyakrylamidové gély) 98% deionizovaný formamid 10 mm EDTA, pH 8,0 0,025% brómfenolová modrá 0,025% xylén-kyanolová sacharóza tlmivý roztok 250 mm sacharóza 38

3.7 Roztoky a pufre 10 mm TrisCl pH 7,4 1 mm EDTA SDS roztok (0,1%) 0,1% SDS 1 mm EDTA 10xTBE ​​1M Tris-HCl 0,83 M kyselina boritá 10 mm EDTA upravené na pH 8,3 TE pufer 10 mm TrisCl, pH 8,0 1 mm EDTA 39

4.1 LHON Toto nové štiepne miesto je spôsobené mutáciou LHON v polohe 11778. Neexistujú žiadne zvyšky pásma divokého typu (255 bp). L K p1 L 607 bp 255 bp 200 bp 125 bp a 130 bp Obrázok 6: Agarózový gél na separáciu reštrikčných fragmentov Mae III Matka pacienta p2 nesie tiež mutáciu homoplazmatickú v obidvoch bunkových radoch. Obrázok 7 zobrazuje štiepenie fragmentu 10 (prípravok leukocytov) reštrikčným enzýmom SfaN1. Kontrola (K) ukazuje 3 pásma (679 bp, 318 bp a 122 bp). V skúmanom fragmente 10 (p2) bolo vynechané jedno štiepne miesto v polohe 11778; pásma 679 bp a 318 bp chýbajú. Namiesto toho vzniká pásmo 997 bp. Tento výsledok súhlasí s trávením Mae-III, ktoré tu nie je uvedené. 41