Prevencia leptínovej rezistencie blokovaním receptorov angiotenzínu II (AT 1) v ráme

1 Z Ústavu experimentálnej a klinickej farmakológie a toxikológie na univerzite v Lübecku riaditeľ: prof. Dr. med. Markus Schwaninger Prevencia leptínovej rezistencie blokovaním receptorov angiotenzínu II (AT 1) v súvislosti s obezitou vyvolanou stravou u potkanov Úvodná dizertačná práca na získanie doktorátu na univerzite v Lübecku - v sekcii medicína - prezentovaná Margot Lau, rodenou Thermannovou z Lübeck Lübeck 2012

prevencia

2 1. reportér: Prof. Dr. rer. nat. Walter Raasch 2. reportér: Prof. Dr. med. D. Ludwig 3. Spravodajca: prof. Dr. med. P. Gohlke Deň ústnej skúšky: Schválené pre tlač: Lübeck, doktorská komisia sekcie medicíny

3 - Pre mojich drahých rodičov-

4 Obsah Obsah Obsah Úvod Inzulínová rezistencia Obezita Systém renín-angiotenzín-aldosterón (RAAS) Materiál a metódy Testovacie protokoly Testovacie zvieratá Vyšetrenie citlivosti na leptín pri telmisartane Vyšetrenie glukózovej tolerancie pri dlhodobom kŕmení stravou v bufete Príprava roztokov Inzulínový roztok Roztok leptínu alebo roztok lieku Aplikácia roztoku telmisartanu Látky Intraperitoneálna aplikácia Perorálna aplikácia Subkutánna aplikácia Extrakcia materiálu Antikoagulanciá a stabilizátory Odber krvi z chvosta Zabitie a odstránenie orgánu Funkčné testy Pletysmografické meranie krvného tlaku Meranie aktivity Test leptínovej rezistencie Orálny glukózový tolerančný test (OGTT)

5 Obsah Test inzulínovej tolerancie (ITT) Biochemické analýzy Rádioimunologický test (RIA) Príprava hypotalami Extrakcia mrna mrna kvantifikácia syntéza cdna Kvantitatívne výpočty Western blot PCR v reálnom čase a štatistické metódy Výsledky Stanovenie testu rezistencie na leptín Kinetika leptínu po jednorazovej aplikácii testu rezistencie na leptín (LRT ) Vplyv telmisartanu na citlivosť na leptín Vplyv liečby telmisartanom na telesnú hmotnosť a energetický príjem Vplyv liečby telmisartanom na plazmaleptín Vplyv liečby telmisartanom na spotrebu energie Vplyv liečby telmisartanom na hemodynamiku Hypotalamické potravinové peptidy podľa testu rezistencie na telmisartan leptín pod telmisartanom Vyšetrovanie glukózovej tolerancie pri dlhodobom kŕmení stravou v bufete Vplyv stravy v jedálni na telesnú hmotnosť Spotreba potravy a vody pri diéte v kaviarni Vplyv stravy v jedálni na telesnú hmotnosť Fyzická aktivita Vplyv stravovania v kaviarni na hemodynamiku Vplyv stravovania v jedálni na bazálne metabolické parametre Orálny test tolerancie glukózy (OGTT) Test inzulínovej tolerancie (ITT) Vplyv stravovania v jedálni na prežitie

6 Obsah 4 Diskusia Vplyv blokády AT 1 telmisartanom na citlivosť na leptín Príjem a spotreba energie pri CD Vplyv CD na rozvoj inzulínovej rezistencie Vplyv CD na úmrtnosť na SHR Outlook Súhrn Bibliografia Príloha Zoznam obrázkov Zoznam tabuliek Látky a zakúpené roztoky Recepty získaných roztokov Testovacie súpravy RIA súpravy Sady na stanovenie génovej expresie Spotrebný materiál Prístroje Zoznam skratiek Poďakovanie Životopis Publikácie Plagát Publikácie Ceny a ocenenia

22 Materiál a metódy heim, 8 mg/kg/d) alebo voda (H20) ošetrená ako kontrola. Všetky potkany si mohli zvoliť medzi stravou v bufete a štandardnou stravou. Po desaťdennej fáze zoznamovania boli potkany náhodne rozdelené do štyroch skupín (n = 10): SD ošetrené TEL/Lep (n = 10) SD ošetrené TEL (n = 26) SD ošetrené TEL/NaCl (n = 10) TEL - ošetrený SD (n = 6): krvný tlak SD ošetrený H20 (n = 20) SD ošetrený H20/Lep (n = 10) SD ošetrený H20/NaCl (n = 10) Obr. 3: Liečebný režim na stanovenie citlivosti na leptín pri telmisartane (TEL) alebo kontrole (H20) pri súčasnom kŕmení jedálňou v bufete. V záverečnom teste rezistencie na leptín sa potkanom Sprague-Dawley (SD) podal subkutánne injekciou buď leptín (Lep) alebo fyziologický soľný roztok (NaCl). Kvôli komplexnému testu rezistencie na leptín na konci štúdie boli zvieratá doručené posunuté o jeden týždeň, takže iba 20 zvierat bolo náhodne rozdelených do štyroch skupín (n = 5) a testovací protokol mohol byť vykonaný analogicky posunutý o jeden týždeň (obr. 4)

25 Materiál a metódy 2.2 Príprava roztokov Inzulínový roztok Ľudský inzulín (Insuman Rapid) v dávke 40 IU/ml sa zriedil 1:80 0,9% NaCI, takže 0,5 IU/ml je 0,5 IU/kg telesnej hmotnosti intraperitoneálne Roztok leptínu (R&D Systems, rekombinantný potkaní leptín, čistota> 97%) sa rozpustil v 20 mm pufri TRIS (tris (hydroxymetyl) aminometán), pH 8, a zriedil sa na koncentráciu 100 alebo 200 ug/ml. Na tento účel sa pôvodne použil tlmivý roztok Tris. Zodpovedajúce množstvo Tris sa odvážilo a v destilovanej vode. rozpustí sa, pufruje sa na požadovanú hodnotu ph 5 N NaOH a zriedi sa na požadovaný objem destilovanou vodou. naplnený. Hotový roztok bol sterilne prefiltrovaný Roztok telmisartanu Roztok telmisartanu (Boehringer, Ingelheim) bol pripravený v koncentrácii 8 mg/ml. Informácie sa týkajú 10 ml zásobného roztoku. Telmisartanový prášok sa odvážil v príslušnom množstve a úplne sa rozpustil v 2 ml 0,1 N roztoku NaOH. 6 ml destilovanej vody. sa pipetou pridali a titrovali sa 0,1 N HCl v rozmedzí pH medzi 8,8 a 9,2. Nakoniec s aqua dest. do 10 ml

26 Materiál a metódy 2.3 Aplikácia liekov alebo látok Intraperitoneálna aplikácia Inzulín sa podával intraperitoneálne (kanyla 0,4 x 13 mm, BD Microlance) v dávke 0,5 IU/kg Perorálna aplikácia Perorálna aplikácia tekutín cez hltan, ktorý sa vložil do pažeráka po tom, ako si zvieratá zvykli. 50% glukózy a telmisartanu v dávke 8 mg/kg sa podávali orálne Subkutánna aplikácia Leptín sa injikoval v dávke 100 a 200 ug/kg do podkožného tukového tkaniva mediálne do lopatky do kožného záhybu nastaveného na tento účel (kanyla 0,4 x 13 mm)., BD Microlance). 2.4 Extrakcia materiálu Antikoagulanciá a stabilizátory Parametre leptín, inzulín, C-peptid, glukagón, adiponektín a kortikosterón sa stanovili z plazmy v mikrovetvách potiahnutých K-EDTA (Sarstedt). Do jatočnej krvi sa pridal roztok Na-EDTA v konečnej koncentrácii 12,1 mm, aby sa stanovil obsah leptínu v plazme