Príprava kvalitného protokolu o inozitolpyrofosfátoch (preložené do nemčiny)

Zhrnutie

Inozitolpyrofosfáty hrajú dôležitú úlohu pri ľudských chorobách, ako sú rakovina, cukrovka a obezita, presný mechanizmus účinku je však kontroverzný. Nedostatok komerčne dostupných inozitolpyrofosfátov spôsobuje, že podrobné štúdie sú problematické. Tu popisujeme jednoduchý protokol na výrobu a izoláciu miligramov inozitolpyrofosfátu.

Abstrakt

Myo-inozitol sa prirodzene vyskytuje buď nezmenený, alebo v zložitejších fosforylovaných derivátoch. Z posledných dvoch najbežnejších v eukaryotických bunkách sú inositol pentakisfosfát (IP 5) a inositol hexakisfosfát (kyselina fytová alebo IP 6). IP 5 a IP 6 sú prekurzory molekúl inozitolpyrofosfátu, ktoré obsahujú jednu alebo viac pyrofosfátových väzieb 1. Fosforyláciou IP 6 sa získa difoshoinositol pentakisfosfát (IP 7 alebo PP-IP 5) a bisdifoshoinositol tetrakisfosfát (IP 8 alebo (PP) 2-IP 4). Inozitolpyrofosfáty boli doteraz izolované zo všetkých eukaryotických organizmov. Okrem toho sú počas vývoja 2-4 vysoko konzervované dve rôzne triedy enzýmov zodpovedných za syntézu inozitolpyrofosfátu.

Kinázy IP 6 (IP 6 Ks) majú obrovskú katalytickú flexibilitu, premieňajú IP 5 a IP 6 na PP-IP 4 a IP 7 alebo a potom použitím týchto produktov ako substrátov podporujúc tvorbu komplexných molekúl 5, 6. Nedávno bola identifikovaná druhá trieda enzýmov produkujúcich pyrofosfáty vo forme kvasinkového proteínu VIP 1 (tiež známeho ako PP-IP 5K), ktorý je schopný prevádzať IP 6 na IP 7 a IP 8 7,8.

Inozitolpyrofosfáty regulujú mnoho rôznorodých bunkových procesov, ako je sekrécia inzulínu 9, dĺžka telomerov 10,11, chemotaxia 12, vezikulárne obchodovanie 13, fosfátová homeostáza 14 a uvoľňovanie gag HIV-1 15. Pre túto triedu molekúl boli navrhnuté dva mechanizmy účinku. Môžu alostericky ovplyvňovať bunkové funkcie interakciou s určitými proteínmi, ako je napríklad AKT 16. Alternatívne môže pyrofosfátová skupina darovať fosfát fosforylovaným proteínom17. Obrovský potenciál tejto výskumnej oblasti brzdí nedostatok komerčného zdroja inozitolpyrofosfátov, ktorý mnohým vedcom bráni v štúdiu týchto molekúl a tejto novej posttranslačnej modifikácii. V súčasnosti dostupné spôsoby izolácie inozitolpyrofosforečnanov vyžadujú zložité chromatografické prístroje 18,19. Tieto postupy využívajú kyslé podmienky, ktoré môžu viesť k rozpadu inozitolpyrofosfátu a tým k zlej regenerácii. Tiež ťažkopádne odsolené postupy v stĺpcoch obmedzujú ich použitie na špecializované laboratóriá.

V tejto štúdii popisujeme nenáročnú metódu na generovanie, izoláciu a čistenie produktov reakcií IP 6-kinázy a PP-IP 5-kinázy. Táto metóda bola umožnená schopnosťou polyakrylamidovej gélovej elektroforézy (PAGE) rozpúšťať vysoko fosforylované inozitolpolyfosfáty 20. Po enzymatických reakciách IP 6 K1 a PP-IP 5 K s použitím IP 6 ako substrátu sa na separáciu generovaných inozitolpyrofosfátov, ktoré sa následne eluovali vodou, použila PAGE.

Protokol

1. Enzymatická reakcia - 1. deň (1 hodina popoludní)

  1. Prvým krokom je príprava 10-20 nezávislých enzymatických reakcií, pri ktorých IP 6 K1 alebo VIP1 konvertujú IP 6, pyrofosforylované izoformy.
  2. Používame enzýmy His-IP 6 Kl a GST-VIP1 purifikované z E. coli podľa protokolu skôr opísaného 17,18.
  3. Pripravte 50 μl reakcií s 1 x reakčným tlmivým roztokom (30 mM Hepes pH 6,8, 50 mM NaCI, 6 mM MgS04, 1 mM DTT), 6 mM fosfokreatínu (PCr), 25 U/ml kreatínfosfokinázy (CPK), 5 mM ATP. (Mg soľ), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 ug His-IP6 Kl alebo GST-VIP1. Úprava hlasitosti pomocou MiliQ ddH 2 O.
  4. Reakcia bola krátko rotovaná a pri 37 ° C cez noc rotáciou.

2. Nalievanie a plnenie polyakrylamidového gélu - 2. deň (4 hodiny popoludní)

  1. Polyakrylamidový gél sa vyrába pomocou 24 cm dlhých, 18 cm širokých sklenených dosiek a 1,5 mm širokých rozperiek. Zvyčajne sa používa 16 jazdných pruhov alebo prípravný hrebeň pre jeden jazdný pruh.
  2. Pripravte zmes (50 ml/gél) s nasledujúcim obsahom: 35,5% (hmotn./obj.) Akrylamid: bisakrylamid 19: 1, 1X tris/boritan/EDTA (TBE), 0,05% (hmotn./obj.) Persíran amónny. (APS), TEMEDOVANÝ 0,05% (hm./obj.). Nalejte zmes medzi prefabrikované sklenené platne, vložte hrebeň a nechajte polymerizovať 30-60 minút pri RT.
  3. Po polymerizácii gélu preneste zariadenia do chladničky a v 1X TBE na približne 30 - 60 minút pri napájaní 200 - 300 voltov.
  4. Do každej reakcie sa pridá 1 X farbiva OrangeG (10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 30% glycerín, 0,1% OrangeG). Pripravte vzorku s 2 nmol IP 6 ako štandardnú kontrolnú záťaž.
  5. Každú jamku dôkladne umyte bežným pufrom pomocou injekčnej striekačky a ihly 21G, aby ste odstránili prípadné zrazeniny, a potom naneste gél. Zabráňte zaťaženiu na strane studne.
  6. Nechajte gél bežať cez noc pri 450 - 550 voltoch (7 MAMP/gél), kým sa farbiaci pás OrangeG nenachádza v posledných 10 cm od spodnej časti gélu.

3. Izolácia IP 7 - deň 3 (4 hodiny) a deň 4 (6-7 hodín sušenia SpeedVac)

  1. Demontujte gélové zariadenie a opatrne odstráňte jednu sklenenú dosku a nechajte gél na druhej. Odrežte malú časť gélu tesne nad páskou farbiva OrangeG v spodnej časti pomocou štandardu IP-6 a stopy vzorky ako v ilustrácia 1 zobrazené.
  2. Narežte časť gélu toluidínovou modrou (0,1% (hmotn./obj.) Toluidínovou modrou, 20% (hmotn./obj.) Metanolom, 2% (hmotn./obj.) Glycerínom) niekoľko minút (1 - 3 minúty) alebo viac. objaví sa páska inozitolpyrofosfátu. Sklenenú platňu predtým vložte späť na vrch gélu, aby ste zabránili vysušeniu nenatretého gélu.

Pásmo IP-7 by malo byť viditeľné, pretože beží o niečo pomalšie ako štandard IP-6. Tiež by mala byť viditeľná ATP bežiaca rýchlejšie ako IP 6 (Obrázok 1). Zafarbená časť gélu sa na niekoľko minút prenesie do odfarbovacieho roztoku (20% (hmotn./obj.) Metanolu), prepláchne sa prebytkom toluidínovej modrej a gél sa umiestni do škvŕn.

Ak je potrebná vizualizácia vyšších pyrofosforylovaných izoforiem inozitolu (IP 8 a IP 9), zafarbí sa gél na 20 minút pri izbovej teplote roztokom na farbenie toluidínovou modrou. Potom toluidínovú modrú premývajte odfarbovacím roztokom asi 15 minút.

4. Stanovenie koncentrácie a čistoty IP 7.

  1. Použite 2 - 5 μl izolovanej vzorky IP 7 na gélovom teste PAGE, podobne ako v častiach 2.2-2.5. Vložte viac riedení IP 6 (tj. 0,5, 1, 2, 4 nmol) ako koncentračného štandardu a 4 nmol poly-P markerov. Po nanesení gélu vizualizujte izoformy inozitolpyrofosfátu zafarbením a odfarbením celého gélu roztokom toluidínovej modrej podľa postupu v časti 3.2. (Obrázok 2A) popísané.
  2. Po zafarbení toluidínom možno koncentrácie určiť skenovaním gélu a porovnaním rozdielov v intenzite medzi IP 6 a IP 7 pomocou zobrazovacieho softvéru, ako napríklad: B. Image-J, ako v Obrázok 2B zobrazené.

5. Reprezentatívne výsledky:

Preparatívna enzymatická konverzia IP 6 na 7 pomocou IP IP 6 K1 a VIP1 enzýmov sa dá ľahko napraviť pomocou PAGE analýzy (Obrázok 1). Naplnenie IP6 ako kontroly veľkosti spolu s farbením gélom na toluidínovú modrú umožňuje identifikáciu pyrofosforylovaných derivátov, ktoré bežia pomalšie, v závislosti od počtu fosfátových skupín na inozitolovom kruhu. Vyššie opísaná metóda umožňuje jednoduché čistenie IP 7. Analýza purifikovaného inozitolpyrofosfátu pomocou PAGE ukázala čistotu nášho IP 7 (Obrázok 2A). Je zaujímavé, že 1/3PP-IP5 izomér produktu IP7 VIP1 migruje o niečo pomalšie ako 5PP-IP5 izomér IP7 generovaný IP 6 Kl. Použitie štandardov IP 6 umožňuje ľahkú kvantifikáciu koncentrácie vyčisteného IP 7 (Obrázok 2B). Pred použitím IP 7 na ďalšie experimenty možno posúdiť jeho biologickú aktivitu
(Obrázok 3). 5PP-IP5 sa inkubuje s VIP1 a s IP7 fosfatázou DDP1 (difosfoinozitol polyfosfát fosfohydroláza). Vyčistená IP 7 až IP 8 VIP1 a IP 6 DDP1 sa bežne čistia (Obrázok 3) prevedený.

príprava
Obrázok 1:. Toluidínové farbenie pomocou PAGE a izolácia IP 7-Band-Der Časť gélu so štandardom (IP6) sa rozrezala a zafarbila roztokom toluidínovej modrej. Tri pásma predstavujú (zhora nadol) IP 7, IP 6 a ATP. Zafarbená časť gélu sa potom vyrovnala so zvyškom gélu. To umožňuje lokalizáciu časti gélu s IP 7, ktorá sa potom rozreže a vyčistí (čiarkovaná škatuľa).

protokolu
Obrázok 2: PAGE analýza reakčných produktov IP 6 K1 a VIP1. A) Analýza IP6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) s farbením toluidínovou modrou sa použila na stanovenie koncentrácie IP7 ako IP6 K1 (5PP-IP5), tak VIP1 (1/3PP-IP purifikovaný 5). ) Reakcie. B) Analýza rozptylového diagramu na stanovenie koncentrácie vyčisteného IP 7. Koncentrácie sa stanovili podľa intenzity pásma vypočítanej pomocou softvéru ImageJ v porovnaní s predtým stanovenými množstvami IP6. Os X predstavuje intenzitu, os Y koncentrácie vyjadrené v nmol.

nemčiny
Obrázok 3: Analýza biologickej aktivity IP 7 Aby sme určili kvalitu purifikovaného IP7, inkubovali sme 5PP-IP5 (IP6 generovaný K1 IP7) s VIP1 alebo s IP7 fosfatázou DDP1 a potom sme sa rozhodli reagovať na PAGE. Farbenie DAPI a toluidínom ukázalo očakávanú produkciu IP 8 pomocou VIP1 a konverziu IP 7 na IP 6 pomocou DDP1.

Diskusia

Použitie inozitolpyrofosfátu v biochémii je výrazne obmedzené komerčnou nedostupnosťou týchto zlúčenín a nízkou citlivosťou existujúcich detekčných metód. Kombinácia PAGE, ktorá umožňuje separáciu molekúl, ktoré majú rôzny počet fosfátových skupín, a toluidínovej modrej (Obrázok 1), metachromatické farbivo, ktoré viaže fosfátové skupiny, umožňuje ľahkú detekciu izoforiem inositol pyrophoshate a otvára tak nové možnosti vo výskume 20.

Popísané použitie technológie PAGE v inozitolpyrofosforečnane na čistenie produktov enzymatickej reakcie uskutočňovanej buď IP 6 K1 alebo VIP1 je jednoduchá, ekonomická a spoľahlivá metóda, ktorá umožňuje výrobu veľkého množstva vysoko kvalitného IP 7. Vyššie opísaná metóda sa neobmedzuje iba na jednoduché čistenie IP 7, ale drobné menšie úpravy opísaného protokolu môžu umožniť čistenie iného rozsahu inozitolpyrofosfátov. Vyššie fosforylované inozitolpyrofosfátové izoformy s viac ako ôsmimi fosfátovými skupinami by mohli byť detekovateľnejšie pri IP 7 alebo pri inom množstve IP 6 ako pri substráte 20.6. Tento inozitolpyrofosfát možno zistiť zväčšením farby a potom vyčistiť (časť 3.2). Použitie IP5 ako substrátu pre enzymatickú reakciu by navyše umožnilo čistenie PP-IP5 a iných inozitolpyrofosfátov s hydroxylovou skupinou na inozitolovom kruhu.

Výsledkom je, že táto nenáročná metóda umožňuje spoľahlivé čistenie miligramových množstiev inozitolpyrofosfátu pomocou široko dostupných nástrojov a otvára tak nové cesty tejto vzrušujúcej oblasti výskumu.

Zverejnenie

Neboli vyhlásené žiadne konflikty záujmov.

Poďakovanie

Ďakujeme A. Ricciovi za užitočné komentáre a za prečítanie rukopisu. Táto práca bola podporená financovaním z Rady pre lekársky výskum (MRC) pre jednotku bunkovej biológie a grantom programu Human Frontier Science Program (RGP0048/2009-C).