Produkcia čistej kultúry - mikrobiologická stáž

V tomto experimente sa majú použiť a vyskúšať rôzne techniky riediaceho náteru (13-riadková a 3-slučková náterová metóda) na získanie čistých mikrobiálnych kultúr.

3-slučková stierková metóda:
Aj tu sa očkovacia slučka žíha a ochladí sa na okraji platne, ktorá sa má naočkovať, predtým ako sa zo vzorky, ktorá sa má zriediť, vyberie očkovacia látka. Očkovacia slučka s očkovacou látkou sa ľahko umiestni na agar a potom sa roztiahne od okraja k okraju, ale bez toho, aby sa ho dotkla, cikcakovým pohybom až asi do tretiny až polovice platničky. Očkovacia slučka sa opäť žíha, ochladí sa, Petriho miska sa otočí o približne 90 ° a potom sa nanesie náter, aby sa materiál umiestnil za prvý náter, ktorý sa pomocou neho prejde prstom a tento materiál sa nechá prejsť na doske distribuuje sa ďalšie „cikcakové hnutie“. Očkovacia slučka sa znovu žíha, ochladí sa, Petriho miska sa otočí o približne 90 ° a použije sa tretí náter, analogicky k postupu pre druhý náter. Nasledujúca skica slúži na ďalšiu ilustráciu techniky trojočkovej línie:

1 týždeň
V tomto experimente bola zmiešaná kultúra Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens a Rhodotorula glutinis s dvoma rôznymi metódami rozmazania, metódou 13 riadkov a metódou rozmazania tromi slučkami, sa na troch rôznych kultivačných médiách (HPG, KB a YGC agar) uskutočnia frakčné rozmazania. Na tento účel sa na spodnú stranu Petriho misiek najskôr označili už naliate a pripravené agarové platne.
Živné médium malo nasledujúce zloženie:

HPG agar
pre 1000 ml aqua demin. boli pridané:

5,0 g kvasnicového extraktu
5,0 g peptónu z mäsa
0,25 g glukózy
15 g agaru

PH bolo upravené na 7,2.

YGC agar
pre 1000 ml aqua demin. boli pridané:

5,0 g kvasnicového extraktu
20,0 g D (+) glukózy
0,1 g chloramfenikol
14,9 g agaru

PH bolo upravené na 6,6.

Kráľ B agar (KB)
pre 1000 ml aqua demin. boli pridané:

20,0 g proteázového peptónu
10,0 g glycerínu (čistý)
1,5 g síranu horečnatého (MgSO4)
1,8 g 3-hydrátu fosforečnanu draselného (K3PO4 × H2)
15,0 g agaru

PH bolo upravené na 7,1.

Z každej z uvedených agarových platní sa jedna naočkovala pomocou 13-riadkovej metódy a jedna pomocou trojriadkovej metódy, takže sa získalo 6 agarových platní. Za týmto účelom bola bunková suspenzia opatrená zmiešanou kultúrou Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens a Rhodotorula glutinis Dobre premiešajte mixérom na skúmavky, potom ochlaďte očistenú očkovaciu slučku na okraji platne s agarom KB a zo suspenzie vyberte inokulum a naneste ho na agarovú platňu pomocou 13-riadkovej metódy. HPG agar a YGC agar sa tiež naočkovali inokulom zo zmiešanej kultúry pomocou 13-líniovej metódy. Zmiešaná kultúra bola potom natretá pomocou 3-slučkovej stierkovej metódy, pričom agar KB, YGC a HPG bol naočkovaný jeden po druhom inokulačnou slučkou. Naočkované agarové doštičky sa potom inkubovali obrátene: HPG doštičky 2 dni pri 25 ° C, YGC doštičky pri 25 ° C asi 5 dní a KB doštičky pri 25 ° C 3 dni.

3 týždne
V treťom týždni sa vykonala kontrola náteru série náterov, pričom sa opäť venovala pozornosť homogenite, izolácii a morfologickým vlastnostiam kolónií, ako aj kontaminácii.
V ďalšom kroku čistá kultúra Pseudomonas fluorescens pripravená jedna šikmá agarová kultúra a jedna kryokultúra.
Poskytnutá šikmá skúmavka bola naplnená HPG agarom (zloženie pozri vyššie) a kryomédium malo nasledujúce zloženie:

Kryomédium

0,5 ml živného roztoku
0,5 ml 85% glycerínu
3 sklenené korálky (z remeselníckych potrieb)

Živné médium obsiahnuté v kryomédiu malo nasledujúce zloženie:

Živné médium
pre 1000 ml aqua demin. boli pridané:

5,0 g mäsového peptónu
3,0 g mäsového extraktu

PH bolo upravené na 7,0.

5. týždeň
V piatom týždni sa všetky platne podrobili makroskopickému vyšetreniu a skontrolovala sa ich čistota, homogenita a kontaminácia. Ďalej sa na všetkých agarových platniach skúmala fluorescencia pod UV lampou (366 nm). Niektorý bunkový materiál sa suspendoval z náteru kryokultúry na HPG agare a očkovacie činidlo sa nanieslo na vyčistené podložné sklíčko mikroskopu a tento náter sa po vysušení 400-krát zväčšil v svetlom poli (pozri 4. týždeň). KB agarová doštička z náteru zo šikmej agarovej kultúry a HPG agarová doštička z kryokultúry sa odložili a použili na katalázový test v experimente D2.

2 týždne
Rast jednotlivých mikroorganizmov sa vyvíjal odlišne: agar YGC bol prevažne s Rhodotorula glutinis, agar KB prevažne s Pseudomonas fluorescens a HPG agar väčšinou s Bacilus subtilis zarastený.
Kontrola rozmazania HPG, YGC a KB agarových platničiek v 3-slučkovom nátere a 13-riadkovej metóde priniesla výsledky uvedené v nasledujúcich tabuľkách:

Tab. 3: kontaminácia Agar: KBYGCHPG

+: kontaminácia -: žiadna kontaminácia Priezvisko: Názov kontaminantu
13-riadková metóda:	+	P. fluorescens	+
3-slučkový náter:	-	+	-

Výsledky charakterizácie morfológie kolónií sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:

Tab. 4: Morfológia kolónií ColorDiameterShapeRandProfileSurfaceConsistencyCulture stredné zafarbenie

YGC: Rhodotorula glutinis	červená	1-2 mm	okrúhly	hladký	konvexný	hladký, lesklý	maslový	-
KB: Pseudomonas fluorescens	biely	1-4 mm	okrúhly	hladký	plochý	drsný	gélovitý	-
HPG: Bacilus subtilis	biely	1-2 mm	okrúhly	hladký	konvexný	hladký, lesklý	slizký	-

3 týždne
Kontrola rozmazania druhého zriedeného rozmazania na HPG agare priniesla nasledujúci výsledok:

Rhodotorula glutinis: kontaminovaný (kontaminant Rhizobium Spóry), dobrá izolácia kolónií
Pseudomonas fluorescens: kontaminovaný (kontaminant Rhizobium Spóry), žiadna izolácia kolónií
Bacillus subtilis: žiadna kontaminácia, dobrá izolácia kolónií

4. týždeň
Kontrola čistoty agarovej šikmej kultúry Pseudomonas fluorescens dal nasledujúci výsledok:

Fluorescencia: Nuž
Makroskopická homogenita: Nuž
Mikroskopická homogenita: Nuž

5. týždeň
Kontrola rozmazania kryokultúry a šikmej kultúry mesta Pseudomonas fluorescens na agare KB a HPG priniesli tento výsledok:

Šikmý agar KB: fluorescenčné, makroskopicky homogénne, bez kontaminácie
Sklon agaru HPG: fluorescenčné, makroskopicky homogénne, bez kontaminácie
Kryo KB: fluorescenčné, makroskopicky homogénne, kontaminované RhizobiumKrypto HPG: fluorescenčné, makroskopicky a mikroskopicky homogénne, bez kontaminácie

Zistilo sa tiež, že žlté sfarbenie kolónií bolo výraznejšie na agare KB ako na agare HPG. Rast na kryokultúrnych doskách bol tiež silnejší ako na náteroch zo šikmej kultúry na agare.

Bill:
Pre glycerín (C3H8O3) bola uvedená hmotnosť 10 g.
Molárna hmotnosť C3H8O3 je výsledkom:
(12u * 3) + (16u * 3) + (1u * 8) = 92u 92 g/mol
Hmotnosť 10 g na 1 l vedie k molárnej koncentrácii:
10 g/92 g/mol = 0,1086 mol/liter

Pre tri-draselný fosfát-3-hydrát (K3PO4 x 3 H20) bola uvedená hmotnosť 1,8 g na 1 000 ml.
Molárna hmotnosť K3PO4 x 3 H2O vyplýva z:
(39u * 3) + (31u * 1) + (16u * 4) + (6u * 1) + (16u * 3) = 266u 266 g/mol
Hmotnosť 1,8 g na l preto zodpovedá molárnej koncentrácii:
1,8 g/266 g/mol = 0,0677 mol/liter

Pre síran horečnatý MgS04 bola stanovená hmotnosť 1,5 g na 1 000 ml.
Molárna hmotnosť MgSO4 je výsledkom:
(24,3u * 1) + (32u * 1) + (16u * 4) = 120,3u 120,3 g/mol
Hmotnosť 1,5 g na l preto zodpovedá molárnej koncentrácii:
1,5 g/120,3 g/mol = 0,0125 mol/liter

V tomto experimente bola katalázová aktivita rôznych bakteriálnych kultúr (Pseudomonas fluorescens a mliečne baktérie).

Kyslík v molekulárnej forme ako molekula O2 má toxický účinok na všetky živé bunkové systémy vďaka svojmu oxidačnému účinku a je tiež známy ako bunkový jed. To platí ešte viac pre anaeróbne organizmy, pretože nepoužívajú kyslík ako koncový akceptor elektrónov dýchacieho reťazca, a preto ho nemôžu zneškodňovať vo forme vody (H2O). Aktivácia kyslíka môže mať 3 rôzne formy, ktoré sú všetky katalyzované takzvanými oxidázami a v ktorých vznikajú nasledujúce medziprodukty:

O2 + 4 e - -> O 2- + O 2- oxidové ióny
O2 + 2 e - -> O2 2- peroxidový ión
O2 + 1 e - -> O2 - superoxidový ión

Pre tieto ióny kyslíka platí to, čo sa zistilo pre molekulárny kyslík, ešte vo väčšej miere: Sú to veľmi reaktívne reaktanty, ktoré môžu spôsobiť trvalé poškodenie bunky a jej zložiek. To je dôvod, prečo väčšina organizmov má enzýmové systémy, vďaka ktorým sú medziprodukty, ktoré sú výsledkom redukcie kyslíka, neškodné. Oxidové ióny reagujú s protónmi za vzniku vody, ktorá je pre bunku neškodná, peroxidové ióny reagujú s protónmi H + za vzniku peroxidu vodíka (H2O2), ktorý je tiež pre bunku veľmi reaktívny a škodlivý. Superoxidový ión reaguje s peroxidom vodíka a vodíkovými protónmi ďalej za vzniku molekulárneho kyslíka, vody a hydroxylového radikálu, ktorý je zase pre bunku toxický. Následné reakcie aktivácie kyslíka sú uvedené opäť nižšie:

Aby sa stal peroxid vodíka neškodným, väčšina aeróbnych organizmov má enzým kataláza, ktorý štiepi H2O2 na vodu a molekulárny kyslík:

Existujú aj peroxidázy, ktoré sú schopné detoxikovať peroxid vodíka protonáciou:

Aby sa zabránilo tvorbe hydroxylových radikálov, majú aeróbne a aerotolerantné organizmy enzým superoxiddismutáza, ktorý premieňa superoxidový ión z aktivácie kyslíka na trochu menej škodlivý peroxid vodíka a molekulárny kyslík:

Anaeróbne organizmy tieto enzýmové systémy zvyčajne nemajú.
Katalázová reakcia sa používa na charakterizáciu mikroorganizmov sledovaním vývoja plynu z molekulárneho kyslíka v organizmoch, ktoré tento enzým majú. Túto reakciu je možné použiť na rozlíšenie medzi aeróbnymi a aneróbnymi organizmami a väčšinou tiež od aerotolerantných organizmov. [2]

V tomto experimente sa použili odložené agarové platne náterov Pseudomonas fluorescens z experimentu D1 (agar KB zo šikmej agarovej kultúry a HPG agarová doštička z kryokultúry), ako aj agarové doštičky zo sterov baktérií mliečneho kvasenia z experimentu H (agar M17 s Streptokok a agaru Rogosa s Lactobacillus) podrobený katalázovému testu. Za týmto účelom bola prvá z agarových platní umiestnená priamo na laboratórny stôl, bolo odstránené veko Petriho misky a bol na ňu vyliaty 3% roztok peroxidu vodíka (H2O2) dostupný z malej Erlenmeyerovej banky, aby bol agar rovnomerne pokrytý tekutinou. Teraz sa krátko čakalo, či sa v kvapaline nad agarom vyvinul plyn, a výsledok sa zaznamenal. Rovnakým spôsobom sa testovali všetky agarové platne. Testované agarové platne sa vyhodili do autoklávového odpadu.

Katalázový test s KB agarom kultúry so šikmým agarom a HPG agarom kryokultúry boli pozitívne, to znamená, že bol vizuálne zistiteľný silný vývoj plynu, ktorý bol charakterizovaný prudkým penením a tvorbou bublín v kvapaline. Obidve agarové platne (M17 agar s Streptokok a agaru Rogosa s Lactobacillus) experimentu H nebol zistiteľný žiadny vývoj plynu.

Na základe tohto experimentu možno konštatovať, že Pseudomonas fluorescens Pozitívny kataláza, a preto má ochranný enzým kataláza, zatiaľ čo baktérie mliečneho kvasenia Streptokok a Lactobacillus Sú negatívne katalázy a neobsahujú enzým katalázu. Takto môže Pseudomonas fluorescens klasifikovať ako aeróbny organizmus a baktérie mliečneho kvasenia ako aspoň aerotolerantné alebo dokonca anaeróbne organizmy.
Je tiež potrebné poznamenať, že výsledný plyn by sa mohol tiež zhromažďovať a podrobovať ďalším vyšetreniam, aby sa overilo, či skutočne ide o kyslík (O2).