Protokol modelu myši Kindling indukovaný pentylenetetrazolom (preložený do nemčiny)

Zhrnutie

Tento protokol popisuje metódu chemického zapaľovania pentylenetetrazolom a poskytuje myší model epilepsie. Tento protokol sa môže použiť aj na vyšetrenie citlivosti na indukciu záchvatov a patogenézy po epileptických záchvatoch u myší.

pentylenetetrazolom

Abstrakt

Úvod

Epilepsia je chronické neurologické ochorenie, ktoré sa vyznačuje opakovanými záchvatmi a postihuje asi 1% ľudí. Základné mechanizmy epileptogenézy a generovania záchvatov u pacientov s epilepsiou nie je možné v klinických štúdiách úplne objasniť. Preto je potrebný vhodný zvierací model na výskum epilepsie 1.

Na štúdium fyziológie epilepsie a na identifikáciu antiepileptík 2, 3 sa použilo množstvo zvieracích modelov epilepsie. Z týchto modelov je farmakologická indukcia záchvatov bežnou metódou generovania zvieracieho modelu na štúdium patológie epilepsie 4. Táto metóda je lacná a ľahká. Osvetlenie sprostredkované elektródami je tiež bežne používanou metódou, ale náklady na zákrok sú vyššie a tento spôsob vyžaduje chirurgické a elektrické zručnosti na vyvolanie opakovaných záchvatov 5.

Farmakologická indukcia je tiež prospešná, pretože načasovanie a počet záchvatov je ľahko kontrolovateľné. Pri štúdiu epilepsie sa používajú aj modely genetických myší, ktoré vykazujú spontánne záchvaty. Predpovedať, kedy a ako často sa v týchto genetických modeloch záchvaty vyskytnú, však nemusí byť možné 6. Na sledovanie epileptického správania geneticky modifikovaných myší je potrebný monitorovací systém 6.

Záchvaty sú často vyvolané jediným systémovým podaním PTZ a zotavenie je veľmi rýchle, do 30 minút 4, 5. Týmto spôsobom sa počet záchytov v modeli zapaľovania PTZ ľahšie ovláda. Monitorovanie EEG však naznačilo, že generalizované skoky možno pozorovať až 12 hodín po záchvate sprostredkovanom PTZ 20. Zvieratá by preto mali prednostne zostať pozorované 24 hodín po tonickom alebo myoklonickom záchvate 21, aby mohli vykonať podrobnejšiu analýzu mechanizmov, ktoré podpaľujú.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

Výbor pre starostlivosť a použitie zvierat v Tokijskom metropolitnom ústave lekárskych vied schválil všetky experimentálne postupy. Odporúčané sú myši vo veku 8 až 16 týždňov. Pre pokus je prijateľný akýkoľvek kmeň príbuzenstva. Myši C57BL/6 sú odolnejšie voči PTZ, zatiaľ čo myši BALB/c a švajčiarske Albino sú citlivejšie na PTZ. V tejto štúdii sa použili C57BL/6. Náchylnosť na PTZ závisí aj od veku myši. V porovnaní s mladšími myšami sú staršie myši odolnejšie voči PTZ-35. Počet zvierat použitých pri tejto metóde sa môže meniť, ale pre každú chorobu je potrebných minimálne 6 - 10 zvierat.

  1. 2 mg/ml PTZ sa rozpustia v sterilnom 0,9% (hmotn./obj.) NaCI. Pripravte si PTZ v deň použitia.

  1. Pozorujte správanie zvieraťa a zaznamenajte výsledky.
    1. Klasifikujte a vyfotografujte epileptické správanie nasledovne 38, 39 (obrázok 1b):
      0: normálne správanie, žiadna abnormalita.
      1: Imobilizácia, ľah na bruchu.
      2: Kývnutie hlavy, tváre, predkolenia alebo myoklónie Megalosauridae.
      3: Kontinuálne celé telo myoklonus, myoklonické trhnutie, chvost držaný strnulo.
      4: výchova detí, tonizujúci záchvat, padanie dole na bok.
      5: tonicko-klonický záchvat, padanie na chrbát, divoké ponáhľanie a skákanie.
      6: smrť.
  2. Zmeňte kritériá správania pomocou Racine Score 40 v závislosti od experimentálnych podmienok.

4. Po analýze záchvatov

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Reprezentatívne výsledky

Opakovaná injekcia PTZ indukuje zvýšenie závažnosti záchvatov. Šesť myší C57BL/6 bolo liečených PTZ a ďalších 6 myší bolo liečených soľným roztokom ako kontrolnou skupinou. Dávka PTZ bola 35 mg/kg a bolo podaných 10 injekcií. Skóre záchvatov sa postupne zvyšovalo pri injekciách PTZ, zatiaľ čo pri injekciách soľným roztokom sa nepozorovali žiadne záchvaty alebo abnormálne správanie (obrázok 2)) boli spôsobené. ANOVA nasledovaná Bonferroniho testom ukázala významný rozdiel medzi skupinou liečenou PTZ a skupinou liečenou soľným roztokom.

Opakovaný záchvat podporuje aberantné vytváranie axonálnych vetiev (klíčenie machových vlákien) a abnormálnu migráciu granulárnych buniek v hipokampe. Myši boli liečené PTZ po dobu 25 injekcií (dávka bola upravená z 24 mg/kg na 35 mg/kg, aby sa zachoval závažný záchvat u myší bez vyvolania smrti z dôvodu závažného záchvatu). Myši mozgu boli fixované 3 týždne po poslednej injekcii. Kontrolné mozgy boli fixované pred injekciami PTZ. Plátky mozgu boli imunobarvené anti-synaptoporínovými (x 500) a anti-ZnT3 (x 500) protilátkami proti klíčeniu machových vlákien (obrázok 3A)) a s anti-dvojkortínovou protilátkou (x 200) na pozorovanie abnormálnej migrácie granulátových buniek (obrázok 3A)). Výhonok machových vlákien vo vrstve zrnitých buniek zaznamenal disky ošetrené PTZ (obr. 3A). Novorodené granulárne bunky, imunoreaktívne pre dvojitý kortín, boli lokalizované v hile v rezoch ošetrených PTZ (obrázok 3A)) pozorované. Granulovaná bunková vrstva a hilus, zobrazené na obrázku 3A je na obrázku 3 bzobrazené.

Diskusia

Tu uvádzame všeobecne dostupný protokol na stanovenie farmakologického zvieracieho modelu epilepsie. Chemické zapaľovanie sprostredkované PTZ má dlhú históriu a je všeobecne akceptovaným modelom pre štúdium histopatológie a bunkovej patológie epilepsie 41. Chemický model zapálenia epilepsie predtým skúmali Suzdak a Jansen, 1995 42. Farmakologická indukcia záchvatov, najmä pomocou PTZ, je jednoduchá a priama metóda na vyvolanie závažných záchvatov. Zmeny v injekčnej dávke korelujú so závažnosťou záchvatov. Preto je veľmi ľahké určiť vhodnú dávku vo viacerých štúdiách zmenou dávky PTZ a výsledného správania.

Mnoho vedcov sa pokúsilo modelovať knock-in alebo knock-in myši, ako je epilepsia, a podarilo sa im vyrobiť myši, ktoré majú spontánne záchvaty 43, 44. Farmakologická indukcia záchvatov však zostáva dobrým modelom pre epilepsiu. Ďalšou bežnou metódou indukcie záchvatov, ktorá sa nazýva genetická modifikácia, je implantácia elektród do mozgu zvieraťa a vyvolanie záchvatov sprostredkovaných elektrošokmi. Táto metóda je nákladná, náročná a vyžaduje chirurgické zručnosti na implantáciu elektródy na presné miesto v mozgu 5.

Chemická indukcia kŕčov umožňuje rýchle vyšetrenie epileptogenézy a antiepileptický skríning liekov pri nízkych nákladoch 2, 4. Frekvencia a závažnosť spontánnych záchvatov a SE sa líšia v závislosti od použitého lieku. Kyselina kainová a pilokarpín sa používajú hlavne na vyvolanie SE a neskôr chronických spontánnych alebo opakovaných záchvatov 45, 46, 47. Na druhej strane sa PTZ používa na podporu SE, keď sa vyvíjate vo vysokej dávke, a na chemicky zapálené zvieratá, ak sa podávajú v subkonvulzívnej dávke 48,49. Okrem toho sú známe mechanizmy konvulzívnych liekov, ktoré vyvolávajú záchvaty. Napríklad blokovanie záchvatového mechanizmu môže pomôcť pri identifikácii antiepileptík. Na druhej strane sú potrebné genetické modely na štúdium mechanizmov, ktoré spôsobujú epileptické záchvaty50. Po objasnení mechanizmov vyvolávajúcich záchvaty sa môže začať skríning antiepileptík.

V tu uvedených reprezentatívnych výsledkoch bolo pozorované správanie zvierat 30 minút po podaní PTZ. Ako je však uvedené v časti Protokol, správanie zvierat sa prednostne pozoruje 24 hodín alebo najmenej 6 - 10 hodín po injekcii PTZ, najmä keď záchvaty dosahujú hodnoty 3 alebo vyššie. Aj keď je na zabezpečenie pozorovania zvieraťa po celý deň potrebný systém sledovania zvierat, pre hlboké pochopenie epilepsie je rozhodujúce dlhodobé pozorovanie. Okrem toho je trvanie záchvatu a latencia záchvatov užitočnými opatreniami na zhromažďovanie. Tieto merania sú dôležité, ak dôjde k zmenám v trvaní záchvatu a latencii z hľadiska času a závažnosti záchvatu.

Študovala sa histopatológia po záchvate chemicky poháňaných zvierat, najmä v hipokampe. Opakované záchvaty alebo SE indukujú klíčenie machových vlákien, 27, 28, abnormálnu migráciu neurónov novorodených granúl 25, 29, astrogliózu v hipokampe 30 a apoptózu pyramídových neurónov 31, 32. tieto histologické zmeny v mozgu narúšajú neurologické funkcie u epileptických pacientov. Napríklad sa rozpoznáva súvislosť epilepsie s poruchou autistického spektra (ASD) a mentálnym postihnutím (ID) 51, 52, 53. Či epileptické záchvaty spúšťajú ASD a alebo ASD a ID indukujú epileptické príznaky, je stále komplikovaná otázka. Posledné štúdie ukázali, že záchvaty sprostredkované PTZ indukujú socio-kognitívne poruchy podobné ASD 54 a deficity učenia podobné ID 55, 56, 57. Tieto výsledky ukazujú, že histopatológia sprostredkovaná epilepsiou spôsobuje neurálnu dysfunkciu a psychiatrické poruchy.

Histologické zmeny podporované epilepsiou si po vyvolaní záchvatov vyžiadajú určitý čas. Farmakologická indukcia záchvatov je z tohto hľadiska prospešná, pretože vedci môžu kontrolovať načasovanie, počet a závažnosť záchvatov u zvierat. Zvieracie modely epileptogenézy vrátane chemického zapaľovania naďalej skúmajú mechanizmus indukcie epilepsie a súvisiace neurofyziologické poruchy.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Zverejnenie

Autori nedeklarujú konflikt záujmov.