Regulácia expresie génov oxidačného stresu u ošípaných ovplyvnená stravou - PDF
1 Regulácia expresie génov oxidačného stresu u ošípaných ovplyvnená diétou Dizertačná práca na získanie akademického titulu doktor rerum naturalium (Dr. rer.nat.) Z Matematicko-prírodnej fakulty Univerzity v Rostocku, ktorú predstavila Bianka Kurts-Ebert, narodená 19. júna. Februára 1975 v Neindorfe z Klingendorfu Rostock,
2 2 Recenzent: Prof. Dr. Manfred Schwerin Research Institute for the Biology of Farm Animals (FBN) Board/Department Functional Genome Analysis Wilhelm-Stahl-Allee Dummerstorf Prof. Dr. Edda Siegl University of Rostock Department of Biology Inst.f. Cell Biology and Biosystems Technology Department of Genetics/Immunobiology Albert-Einstein-Str Rostock Dátum obhajoby: 14. januára 2007
3 OBSAH Zoznam skratiek Zoznam obrázkov Zoznam tabuliek Úvod Stav výskumu Vplyv výživy na metabolizmus a zdravie Prenatálne metabolické programovanie Včasné postnatálne metabolické programovanie Príčiny pretrvávajúcich fyziologických a metabolických zmien Dedičná schopnosť metabolického programovania Metylácia DNA Možný mechanizmus metabolickej aktivity metylácie DNA Methylácia DNA Mechanizmus inaktivácie génov prostredníctvom modelovania chromatínu metylácia DNA ako možný molekulárny mechanizmus pre trvalé metabolické účinky súvisiace so stravou Úloha Materiál a metódy Experimentálny prístup: Diéty a zvieratá Izolácia nukleových kyselín Izolácia RNA Izolácia genómovej DNA
5 Obsah 5 6. Diskusia Dlhodobé zmeny v reakcii na oxidačný stres spojené s diétou Metylácia DNA - mechanizmus pretrvávajúcich zmien génovej expresie Zhrnutie Zhrnutie Bibliografia Príloha 149 A. Zdroje dodávky A.1 Zariadenie A.2 Biologické látky, chemikálie, roztoky a pufre
7 ZOZNAM SKRATIEK AARE Element na odpoveď na aminokyseliny AC acetylácia podľa pr. Číslo Prístupové číslo AP1 Aktivátor Proteín 1 BHMT bp Betaín-homocysteín-metyltransferáza Základné páry CAS CANX cdna CpG Kazeín Kalnexín Kópia Deoxyribonukleová kyselina Cytozín-fosfatidyl-guanozín ddh2o dvakrát destilovaná voda ddntp didesoxyribonukleová kyselina-DNA -Metyltransferáza dpm bodov za minútu dntp (datp, dctp, deoxyribonukleozid-5-trifosfát dgtp, dttp) (A = adenozín, C = cytozín, G = guanozín, T = tymidín) DTT ditiotreitol [3H] dctp deoxycytidín 5 -tri tetrasodná soľ, [5,5 3H] EDTA etyléndiamíntetraacetát
8 8 Zoznam skratiek FBN FDR FP Výskumný ústav pre biológiu hospodárskych zvierat Fals Discovery Rate Kŕmne obdobie GSTA1 GR Glutathion-S-Transferáza A1 Glukokortikoidný receptor HDAC Histón Deacetyláza HDL Vysokohustotný lipoproteín HMT Histonmetyltransferáza HP1 Šok ICF Prepis Faktor 1 Faktor transkripcie ICF Imunodeficiencia Centromerická oblasť Nestabilita a anomálie tváre Inzulínový rastový faktor kb Kilobáza (n) LB LDL LT Luria Bertani Lipoproteíny s nízkou hustotou Dni života MBD MeCP mrna MS MSRA MTF 5MTHF Metyl viažuca doména Metyl-CpG viažuce proteíny Messenger Ribonukleová kyselina Metionínová syntéza 5-metyltetrahydrofolát reduktázy A metyltransferázy NfκB nukleárny faktor bb
9 Zoznam skratiek 9 OATP2 Transport organických aniónov Polypeptid 2 PAC PCR P1 Umelá chromozómová polymerázová reťazová reakcia Repr. ROS rpm RT Represor druhov CAR1- faktora reaktívneho kyslíka počet otáčok za minútu Reverzný prepis SAM S-Adenosylmethionín SP1 Špecifický proteín 1 SPI Sójový proteín T izolát T N, N, N tetrametyletyléndiamín Transkripčný faktor tris- (hydroxymetyl) aminometán USF URS Upstream Response Element Upstream Represná sekvencia YAC Kvasinky Umelý chromozóm
10 10 Zoznam skratiek
11 ZOZNAM OBRÁZKOV 2.1 Vplyv výživy matky na vývoj plodu a účinky na choroby v post-reprodukčnej fáze života Fyziologické zmeny, ktoré vedú k metabolickému programovaniu a ochorenia v post-reprodukčnej fáze života Oxidačný stres - potenciálny mechanizmus pre dlhodobé metabolické zmeny súvisiace s výživou Cytozínová metylácia Proces metylácie DNA Obsah metylovej skupiny Obsah aminokyselín bielkovín v experimentálnych diétach CAS a SPI Diéty a zvieratá Príklad bimodálnej teplotnej krivky topenia Schematické znázornenie sekvenovania bisulfitovo modifikovanej genómovej DNA Po pôsobení hydrogensiričitanom už reťazce DNA nie sú komplementárne Chemická sekvencia hydrolytickej deaminácie cytosínu na uracil indukovaná hydrogénsiričitanom Pyrosekvenovanie pyrogramu Priemerná hmotnosť (kg) zvierat v príslušnej kŕmnej skupine pred začiatkom F skúška kŕmenia a po jednotlivých obdobiach kŕmenia Hladiny pečeňovej transkripcie génov reakcie na oxidačný stres po štyroch týždňoch kŕmenia diétou SPI s následným prechodom späť na stravu CAS v porovnaní s kontrolnou skupinou CAS
13 ZOZNAM TABULIEK 2.1 Účinky ontogeneticky skorej reštrikcie proteínov Vývoj a tkanivovo špecifické zmeny v metylácii a ich vplyv na expresiu Syndrómy a rakoviny, ktoré vznikajú z nesprávnych funkcií metylácie v mechanizme imprintingu Príklady vývoja nádoru prostredníctvom hypermetylácie DNA a súvisiacej inaktivácie nádorov - Cyklus PCR supresorového génu pre sekvenovanie s cyklom LICOR LightCycler PCR Cyklus PCR pre amplifikáciu 5-závodného PCR cyklu pre amplifikáciu bisulfitovo upravenej DNA Izolácia klonov GSTA1-PAC Priméry použité na meranie rýchlostí transkripcie Priméry použité na sekvenovanie 5-neprekladanej oblasti. Priméry použité na amplifikáciu produktov PCR. Priméry použité na sekvenovanie metylačných miest. Priméry použité na identifikáciu 5-neprekladanej oblasti. Korelácia. koeficienty z úrovne pečeňovej transkripcie skúmaných génov a telesnej hmotnosti ošípaných. 76
14 14 Zoznam tabuliek
21 2.1. Dopad výživy na metabolizmus a zdravie 21 Obr. 2.2: Fyziologické zmeny, ktoré môžu viesť k metabolickému programovaniu a chorobám v postprodukčnej fáze života. Pre- a skorá postnatálna podvýživa môže viesť k zmenám koncentrácií hormónov, čo môže mať za následok trvalé metabolické adaptácie. Fenomén dlhodobých fyziologických účinkov spojených so stravou zaisťuje prežitie v nepriaznivých výživových podmienkach, aj keď programovanie môže mať negatívne účinky na zdravie v postprodukčnej fáze života [9, 44].
24 24 2. Súčasný stav výskumu Obr. 2.3: Oxidačný stres - potenciálny mechanizmus pre dlhodobé metabolické zmeny súvisiace so stravou Strava založená na sójových proteínoch (SPI), ktorá sa vyznačuje nevyváženým obsahom aminokyselín, spôsobuje zvýšenú expresiu oxidačných génov v pečeni rastúcich ošípaných. Stresová reakcia v dôsledku indukcie oxidačného stresu [25, 51, 95].
31 2.2. Metylácia DNA: možný mechanizmus metabolického programovania 31 Tabuľka 2.4: Príklady vývoja nádoru prostredníctvom hypermetylácie DNA a súvisiacej inaktivácie génov potlačujúcich nádor Nádorový supresor Typ (typy) nádoru P16 Perorálny karcinóm [185] p57kip2 Pľúca u.brustkrebs [186] RASSF1A gliómový karcinogén, karcinóm prsníka [187, 188] karcinóm renálnych buniek [189] p16/rassf1a/hmhl1 intra- a extrahepatálny [190] GSTP cholangiokarcinóm APC karcinóm prsníka [188] DAP kináza karcinómu prsníka [191] hdab2ip ] Runx3 rakovina hrubého čreva [192] EXT1 leukémia, rakovina kože [193] PTEN rakovina prsníka [194] LOX rakovina žalúdka [195] Obr. 2.4: Metylácia cytozínu DNA metyltransferáza katalyzuje prenos metylovej skupiny na cytozín. Vznikne 5-metylcytozín.