Rozpoznávanie enzýmu a substrátu v reakciách skladania katalyzovaných proteínov - PDF na stiahnutie zadarmo

Rozpoznávanie enzýmu a substrátu pri katalyzovaných reakciách skladania proteínov

rozpoznávanie

Rozpoznávanie enzýmového substrátu v katalyzovaných reakciách skladania proteínov Dizertačná práca na získanie akademického titulu doctor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) Prezentovanú Fakulte prírodných vied I Biosciences na Univerzite Martina Luthera v Halle-Wittenberg absolventkou chemičky Caroline Hauptovej narodenej 28. júna 1980 v Karlsburg Halle (Saale) 2009

Doktorandská prihláška podaná: 8. októbra 2009 Deň vedeckého kolokvia: 21. decembra 2009 Recenzent: (1) Prof. Dr. Milton T. Stubbs (2) prof. Dr. Jochen Balbach (3) PD Dr. Jochen Reinstein

Skutočný vedec počúva inteligenciu prírody a vidí podstatu vecí. Anthony G. E. Blake

Obsah 3.2.3. Súhrnná diskusia: lokalizácia väzbových miest v SlyD * a charakterizácia aktivity chaperonu. 103 3.3. Funkcia peptidyl-prolylizomerázy SlyD *. 105 3.3.1. Dôležitosť mutácie Y68W pre katalytický mechanizmus prolylizomerázy SlyD *. 105 3.3.2. Štúdia NMR v reálnom čase na katalyzovanie opätovného skladania RNázy T1 (S54G/P55N). 107 3.3.2.1. 3D NMR spektroskopia pre priradenie kinetického skladacieho medziproduktu RNázy T1 (S54G/P55N). 108 3.3.2.2. NMR spektroskopický objav druhej konformácie v natívnej RNáze T1 (S54G/P55N). 111 3.3.2.3. Pozorovanie katalýzy opätovného skladania pomocou sériovo zaznamenaných spektier 2D1H/15N-TROSY-HSQC. 113 3.3.3. Súhrnná diskusia: NMR pozorovanie v reálnom čase SlyD * katalyzovaného opätovného skladania prechodného skladacieho medziproduktu RNázy T1 (S54G/P55N). 119 4. Zhrnutie. 121 5. Zhrnutie. 123 6. Zoznam skratiek. 125 7. Bibliografia. 129 8. Príloha. 143 8.1. Ilustrácie. 143 8.2. Tabuľky. 159 8,3. Pulzné programy. 175 8.4. Makra Felix. 191 9. Vlastné publikácie. 193 10. Životopis. 194 11. Poďakovanie. 195 III

Optimalizujú sa úvodné teploty a katalytické podmienky. Pre túto otázku je navyše nevyhnutný vývoj a prispôsobenie metód NMR v reálnom čase, ktoré sa majú použiť. Cieľom tejto práce by preto malo byť molekulárne pochopenie katalýzy reakcií pomalého skladania pomocou PPIáz, ako aj doménová komunikácia medzi chaperonovými a PPIázovými doménami SlyD *. 19

Rozmery materiálov a metód zaznamenané. Trvanie spektra FHSQC bolo 4 minúty 52 s a spektrá sa hodnotili analogicky k NMR titráciám a analýze chemického posunu pomocou rovnice [2.14]. 59

Výsledky a diskusia označené. Hlasitosť krížových signálov sa používa na vyhodnotenie prechodu vývoja. Pokles objemu sa pozoruje u krížových vrcholov pôvodného druhu a nárast objemu u signálov denaturovaného druhu s iným chemickým posunom. Celkovo bolo možné vyhodnotiť natívny stav 93 aminokyselinových zvyškov (príloha, tab. 8-1). Obr. 3-6 1H/15N TROSY spektrum SlyD * počas rozkladu vyvolaného močovinou. Spektrum SlyD * v natívnom stave pri 0 M močovine, B v rozvinutom stave pri 5,5 M močovine a C v prechodnom strede pri 2,2 M močovine. Prechod sa meral v 50 mm Na2HP04, 100 mm NaCI, 10% D20, pH 7,5 pri 15 ° C a koncentrácii proteínu 0,67 mm. Zodpovedajúca krivka prechodu pre priradené krížové signály je znázornená na obr. 3-7. Niektoré príklady krížových signálov ukazujúcich prechodovú krivku podľa dvojstavového modelu sú zobrazené na obr. 3-7. Zvyšky, ktorých krížové vrcholy boli 68

Výsledky a diskusia A B Obr. 3-14 H/D výmena SlyD *. A Ochranné faktory hlavných reťazcov amidových protónov SlyD * v logaritmickom grafe. Obdĺžniky predstavujú sekundárne konštrukčné prvky, plné obdĺžniky znamenajú β-listy, otvorené obdĺžniky pre α-helixy. B Oblasti vysokých (S> 10 4, modré) a nízkych ochranných faktorov (10 2 S 10 4, azúrová) umiestnené na štruktúre SlyD *. Ochranné faktory boli vypočítané podľa rovnice [2.26]. Oblasti, v ktorých sa príslušné krížové signály vymenili v mŕtvom čase experimentu (40 minút), sú zobrazené sivou farbou. Nepriradené zvyšky a prolíny sú zafarbené čiernou farbou. Amidová výmena protónov na stanovenie reakcií rýchlej výmeny S upravenou technikou MEXICO (nové MEXICO, 2.7.6.) Možno procesy výmeny určovať v časovom okne od 10 ms do 250 ms. Pre 47 amidových protónov, ktorých výmenu za protóny v rozpúšťadle nebolo možné zistiť výmenou H/D kvôli nižšej ochrane, sa v stanovenom časovom okne analyzovali vyššie výmenné rýchlosti pomocou aplikácie New MEXICO. Obrázok 3-15D zobrazuje prestavbu magnetizácie amidových protónov výmenou polarizovaných vodných protónov.

Výsledky a diskusia Obr. 3-15 Rýchla výmena amidových protónov (nové MEXICO). Spektrá A-C1H/15 N-FHSQC pred výmenou amid-protón (referencia) a 60 ms alebo 250 ms po začiatku výmennej reakcie. D Výmenná kinetika pre vybrané aminokyselinové zvyšky SlyD * pri pH 7,5 a 15 C. Prispôsobenie kinetiky mono-exponenciálnej funkcii viedlo k výmenným kurzom 512 ± 5 s -1 (R95), 37 ± 3 s -1 (G86), 14 ± 2 s -1 (S40) a 12 ± 2 s -1 (Q102). Zadané chyby sú výsledkom adaptácie na mono-exponenciálnu funkciu. Vyhodnotenie výmenných reakcií z hľadiska termodynamickej stability je možné vykonať, iba ak výmenný proces prebieha podľa mechanizmu EX2 (2.7.6). Kvôli závislosti na ph príslušnosti k mechanizmu EX1 alebo EX2 sa nový experiment MEXICO opakoval s dvoma ďalšími hodnotami ph (ph 6,0, ph 9,0). Prechod do rozsahu EX1 možno pozorovať u 20 zvyškov pri vysokej hodnote pH. Tieto sú z termodynamického hľadiska vynechané. Ochranné faktory a termodynamická stabilita boli vypočítané pre zvyšných 27 aminokyselinových zvyškov podľa rovnice [2.26] (príloha, tab. 8-8). 79

7,0 kj/(m mol). Prítomnosť IF domény znamená pre SlyD * v porovnaní s izolovanou doménou FKBP (SlyD * - IF, GU (H20)

4,7 kj/(m mol)), enormný nárast stability a výrazné zvýšenie spolupráce. To tiež vysvetľuje spoločný vývoj oboch domén. SlyD * sa rozkladá ako kooperatívna skladacia jednotka, v ktorej sa nedá zložiť ani jedna z dvoch domén lokálne, keď je zložená druhá. Pomocou teórie výmeny vodíka v natívnom stave by sa tiež mohlo preukázať, že FKBP sa rozkladá ako jednotka s doménou IF, pretože nebolo možné detegovať žiadne čiastočne poskladané medzistavy alebo poskladané podjednotky. V prítomnosti Ni 2+ existuje značná termodynamická stabilizácia SlyD (1 - 155). Jeho porovnaním s kryštálovou štruktúrou TtSlyD (Löw et al., 2009) by sa dalo lokalizovať väzobné miesto kovového iónu. Nachádza sa v poslednej a-helixe (a3) ​​domény FKBP v motíve histidínu: His149-Gly150-His151-Val152-His153 v E.c.SlyD alebo His145-Gly146-His147-Ala148-His149 v TtSlyD. Táto posledná a-helix je medzi proteínmi viažucimi FK506 jedinečná a vyskytuje sa iba v FKBP, ktoré sú homológne so SlyD. Predstavuje teda nielen nový štrukturálny, ale aj nový funkčný prvok

Zoznam skratiek 6. Zoznam skratiek 1D, 2D, 3D, jednorozmerný, dvojrozmerný, trojrozmerný A 280 nm AcCN Amp A.U. a.u. bp BEST BSA alebo c CD CsA C p δ MW G u (H 2 O) H u (T m) S u (H 2 O) n d [D] [D] 1/2 ddh2o DNA DTT dyt ε E A E.c. (E. coli) EDTA ESI FID absorpcia FKBP pri 280 nm absorpčné jednotky acetonitrilu ampicilínu ľubovoľné jednotky bázový pár (DNA) pásmo selektívna excitácia krátkodobý prechodný hovädzí sérový albumín (hovädzí sérový albumín) alebo koncentrácia cirkulárny dichroizmus cyklosporín zmena tepelnej kapacity (izobarický proces) priemerná zmena chemická posunová stabilizácia bez entalpie v neprítomnosti denaturantu van t Hoffova entalpia zmena entropie počas rozvinutia rozdiel indexov lomu hrúbka vrstvy kyvety (v dm) denaturačná koncentrácia prechodný stredný bod v denaturantom indukovanom rozvinutí dvojnásobne deionizovaná voda (reziduálna vodivosť 0,055 µsitiothreitolová kyselina (stredná tryptonukleová kyselina) ) molárny extinkčný koeficient aktivačná energia Escherichia coli etyléndiamíntetraacetát elektrosprej ionizácia ionizácia bez indukcie rozpad FK505 väzobný proteín 125

Zoznam skratiek FT GdmCl HCl HMQC hnoe HSQC Hz (MHz, GHz) IF INEPT IPTG ITC k 0 k cat k cat/KM k ch k cl KDK eq k int k kat KK KM k op N n NaOH NMR NOE NOESY M m (nové) MEXIKO min. Min. Štvrtá transformácia guanidíniumchlorid kyselina chlorovodíková heteronukleárna mnohonásobná kvantová koherencia heteronukleárny efekt NOE heteronukleárna jedna kvantová koherencia Hertz (s -1) (Megahertz, Gigahertz) zosilnenie jadier necitlivých na inzert vo chlopni prenosom polarizácie izopropyl-β-D-tiogalorimopyranometria Rýchlosť nekatalyzovanej refoldovacej reakcie Rýchlosť obratu Katalytická účinnosť enzýmu chemická výmenná rýchlosť Uzatváracia rýchlosť Disociačná konštanta Rovnovážna konštantná vnútorná výmenná rýchlosť (určená pre modelové peptidy) Rýchlosť katalyzovanej refoldovacej reakcie Hydrofóbny peptid zo sekvencie signálneho peptidu HiPIP s dvoma lyzínmi namiesto arginínu Michaelis-Menten konštantná rýchlosť otvárania sodíka Magnetický R esonancia Vylepšenie jadrového overhausera Vylepšenie jadrového overhauseru Spektroskopia molárna (mol/l) Meranie parametrov kooperativity pri rýchlom výmene protónov v izotopovo značených zlúčeninách Minúta najmenej 126

Zoznam skratiek MS Ni-IMAC OD P PCR PPIáza ppm RCM-T1 RCM-α-La RNáza T1 RR s SDS-PAGE SlyD SlyD * SOFAST SUMO T m Tat Tat27 TEMED TFA TFE TOCSY TPPI (Bis-) Tris TROSY U u.u. UV VRR (v/v) WATERGATE WHP hmotnostná spektrometria Ni-iónová kovová afinitná chromatografia faktor optickej hustoty ochranný faktor polymerázová reťazová reakcia peptidyl-prolyl-cis/trans-izomerázový diel na milión redukovaný a karboxymetylovaná RNáza T1 redukovaná a karboxymetylovaná a-laktalbumín ribonukleáza T1 hydrofóbny peptid z HiPIP- Sekvencia signálneho peptidu druhá Sekvencia dodecylsulfátu sodného polyakrylamidového gélu elektroforéza citlivosť na lýzu D EcSlyD (1-165) selektívna pre pásmo optimalizovaný uhol otočenia krátky prechodný malý modifikátor podobný ubikvitínu na prechodnom centre sekvencia signálneho peptidu dvojitého arginínu transklonového signálneho peptidu z CueO N, N, N, N -Tetrametyldiamín Kyselina trifluóroctová Trifluóretanol celková korelačná spektroskopia čas proporcionálna fázová inkrementácia Tris- (hydroxymetyl) aminometán priečna relaxácia optimalizovaná spektroskopia rozvinutý stav okrem iného otáčky za minútu za určitých okolností ultrafialový hydrofilný peptid zo sekvencie signálneho peptidu HiPIP objem na objem wat potláčanie erupcie úžasnou bielkovinou bohatou na histidín gradientovo excitovanou excitáciou 127

Zoznam skratiek (w/v) YpSlyD napr. Hmotnostná hmotnosť SlyD napríklad z Yersinia pestis, napríklad aminokyseliny, boli skrátené obvyklými jedno- alebo trojpísmenovými kódmi. 128

Dodatok 8. Dodatok 8.1. Obrázky Obr. 8-1 Fluorescenčné emisné spektrum 5 um SlyD * v 50 mm Na2HP04, 100 mm NaCl, pH 7,5 pri 15 ° C. Excitácia prebiehala pri 278 nm. Plná čiara predstavuje natívny stav, krivka rozloženého stavu Proteín je zobrazený prerušovanými čiarami. Obr. 8-2 Prechod na rozklad rozvinutý močovinou SlyD * -F84W. Detekcia prechodu pri 308 nm po excitácii pri 280 nm (trojuholníky), detekcia pri 344 nm po excitácii pri 295 nm (kruhy). Plné čiary predstavujú prispôsobenie údajov dvojstupňovému modelu. Výsledné parametre stability sú (po excitácii pri 280 nm): GU (H20) = 16,8 ± 0,7 kj/mol, m eq = 6,8 ± 0,3 kj/(m mol), [D] 1/2 = 2,5 M. Druhý prechod, ktorý je znázornený zväčšený v B, nebolo možné vyhodnotiť. Plná čiara slúži iba na ľahšie prezeranie. Prechod sa meral v 50 mm Na2HP04, 100 mm NaCI, pH 7,5 pri 15 ° C. Koncentrácia proteínu bola 5 um. 143

Príloha Obrázok 8-3 Prechod vývoja močovinou vyvolaného prechodu zo SlyD * - IF. Rozvíjajúci sa prechod od SlyD * (otvorené symboly) a SlyD * - IF (zatvorené symboly). Plné čiary predstavujú prispôsobenie údajov dvojstupňovému modelu. Výsledné parametre stability pre SlyD * sú: GU (H 2 O) = 18,4 ± 0,6 kj/mol, m eq = 6,9 ± 0,2 kj/(m mol), [D] 1/2 = 2,7 M a pre SlyD * - IF: GU (H20) = 13,9 ± 0,5 kj/mol, m eq = 3,2 ± 0, 1 kj/(m mol), [D] 1/2 = 4,3 M Prechody sa merali v 50 mm Na2HP04, 100 mm NaCI, pH 7,5 pri 15 ° C. Koncentrácia proteínu bola 5 um. Obr. 8-4 Izotermické titračné kalorimetrické údaje dvoch homológnych SlyDs s Ni 2+. Integrované množstvo tepla sa vynieslo proti koncentračnému pomeru ligand/proteín. V obidvoch prípadoch možno pozorovať dve záväzné udalosti, ale prispôsobenie údajov zodpovedajúcemu väzbovému modelu nebolo možné kvôli vzájomne prepojeným procesom. Izotermická titrácia 18 um TtSlyD-His 6 s 270 um NiCl2 (v 10 mm Tris, pH 25 C 7,5, 25 C). B Izotermická titrácia 16 μm E.c. SlyD (1-165) -His 6 s 240 μm NiCl 2. 144

Príloha Obr. 8-5 Izotermické titračné kalorimetrické krivky TtSlyD s Co 2+, Gd 3+ a Zn 2+. Horný obrázok zobrazuje elektrickú energiu, ktorá sa zistila po každom vstreknutí príslušného iónu kovu. Na nasledujúcom obrázku sú integrované množstvá tepla vynesené proti koncentračnému pomeru kovový ión/TtSlyD. Termodynamické parametre sa získali z nelineárneho prispôsobenia experimentálnym údajom na väzbovom modeli s väzbovým miestom. Izotermická titrácia 27 um TtSlyD s 270 um CoCl2 (v 10 mm Tris, pH 25 C 7,5, 25 C). Entalpia reakcie uvoľnenej väzbou bola -13,2 ± 0,2 kcal/mol; afinitná konštanta bola 2,4 ± 0,2 x 106 M-1. To viedlo k hodnote Kd 420 nm.Dáta zobrazené červenou farbou zodpovedajú titrácii TtSlyD s GdCl3. Nebolo možné stanoviť väzbu Gd3+. B Izotermická titrácia 27 um TtSlyD s 270 um ZnCl2 (v 10 mm Tris, pH 25 C 7,5, 25 C). Entalpia reakcie uvoľnenej väzbou tu bola -10,0 ± 0,1 kcal/mol; afinitná konštanta bola 9,8 ± 1,5 x 106 M-1. Výsledná hodnota Kd bola 102 nm, 145

Príloha Obr. 8-6 NMR titrácia 15 N-SlyD * s natívnou RNázou T1 (S54G/P55N) v 50 mm Na2HP04, 100 mm NaCl, pH 7,5 pri 25 ° C. Zmena chemického posunu niektorých krížových vrcholov je založená na o nešpecifických interakciách neštruktúrovanej C-terminálnej časti a značky His 6. Obr. 8-7 Fluorescenciou detegovaná titrácia Tat27 s SlyD * v 50 mm Na2HP04, 100 mm NaCl, pH 7,5 pri 25 ° C. Plná čiara zodpovedá adaptácii na jednoduchý model väzby s jedným miestom väzby. Stechiometria 1 vedie k disociačnej konštante 0,5 ± 0,1 um. Aminokyselinová sekvencia peptidu Tat: QRRDFLKYSVALGVASALPLWSRAVFA. 146

Príloha Obr. 8-8 Titrácia 15 N-SlyD * pomocou RCM-T1. Závislosť zmeny chemického posunu na koncentračnom pomere RCM-T1 k SlyD * (A) a na koncentrácii substrátu RCM-T1 (B) pre dva amidové protóny D88 a S26 z NMR titrácie. A Rovnovážna väzbová krivka sa získa z lineárneho preloženia. Bod ekvivalencie je okolo 1 a označuje komplex 1: 1. B Plné čiary sú určené iba na vedenie oka, ale nemajú žiadny fyzický význam. C Fluorescenciou detekovaná titrácia RCM-T1 pomocou SlyD *. Plná čiara zodpovedá prispôsobeniu jednoduchému modelu väzby s bodom väzby. Stechiometria 1 vedie k disociačnej konštante 4,4 ± 0,8 um. Obidve titrácie sa uskutočňovali v 50 mm Na2HP04, 100 mm NaCI, pH 7,5 pri 25 ° C. 147

Príloha Obr. 8-9 1 H/15 N-FHSQC spektrum izolovanej IF domény v prítomnosti 0,5 M (NH4) 2S04 pri 25 ° C. Krížové vrcholy rozvinutého druhu sa vyskytujú hlavne v strede Spektrum pri 7,8 až 8,4 ppm. Intenzita disperzných signálov štruktúrovaných druhov je približne 30%. Obr. 8-10 Sekvencia 1D1H spektra 450 um inzulínu po začiatku agregačnej reakcie pri 25 ° C pridaním DTT. Je znázornená oblasť nízkeho poľa s niekoľkými signálmi z amidových protónov reťazca A. 148

Príloha Obr. 8-13 1 H/15 N-heteronukleárny NOE pri 14,2 T a 25 ° C pre SlyD * (čierna) a SlyD * -Y68W (červená). Rozdielna dynamika dvoch domén v týchto dvoch proteínoch je zreteľne viditeľná na časovej škále picobis nanosekundovej NMR; doména IF je oveľa pružnejšia ako doména FKBP. V oblasti okolo W68 vykazuje mutant zvýšenú dynamiku. Údaje o poníkoch láskavo sprístupnil Michael Kovermann. Obr. 8-14 Termodynamická stabilita SlyD * proti GdmCl. Prechod vývoja SlyD * vyvolaný GdmCl v 10 mm Tris, ph 20 C 7,5 pri 20 C (A) a v 10 mm Bis-Tris, ph 10 C 6,0 pri 10 C (B). Plné čiary predstavujú adaptáciu údajov na dvojstavový model s nasledujúcimi parametrami stability: GU (H 2 O) = 15,3 ± 1,4 kj/mol, m eq = 13,7 ± 1,1 kj/(m mol) a [D] 1/2 = 1,1 M (ph 7,5, A) alebo GU (H20) = 12,0 ± 0,8 kj/mol, m ekv = 13,0 ± 0,6 kj/(m mol) a [D] 1/2 = 0,9 M (ph 6,0, B). Koncentrácia proteínu bola 2 um (A) a 5 um (B). Chyby vyplývajú z prispôsobenia údajov rovnici [2.10]. 150

Dodatok 10 9 8 7 6 5 1 H (ppm) Obr. 8-15 1H spektrum SlyD * v 10 mm Tris, ph 20 C 7,5 v prítomnosti GdmCl. Je jasne vidieť nízke rozlíšenie a intenzita signálu v prítomnosti GdmCl (0,4 M GdmCl (červené spektrum) a bez GdmCl (modré spektrum)). 151

Príloha Obr. 8-16 naskladaný graf pre opätovné zloženie RNázy T1 (S54G/P55N). Sekvencia 1D 1H spektier 1,9 mm RNázy T1 (S54G/P55N) v neprítomnosti (A) a prítomnosti 190 um SlyD * (B). Je zobrazená oblasť s nízkym poľom s amidovou protónovou oblasťou. Časové rozlíšenie na spektrum bolo 5 minút 21 s, pretože na zlepšenie pomeru signál/šum sa spriemerovali štyri po sebe nasledujúce spektrá. 152