Štúdie o antioxidačnej účinnosti zložiek polyfenolového jablkového džúsu v roku 2006

Štúdie o antioxidačnej účinnosti prísad polyfenolového jablkového džúsu v bunkách ľudského hrubého čreva Dizertačná práca schválená katedrou chémie Technickej univerzity v Kaiserslauterne na udelenie akademického titulu doktor prírodných vied (D386), predložená absolventkou potravinárskej chemičky Sandrou Schäfer Kaiserslauternovou, 2006

Táto práca bola vytvorená v období od júna 2002 do novembra 2005 na katedre chémie, potravinárskej chémie a toxikológie životného prostredia na Technickej univerzite v Kaiserslauterne. Deň vedeckej diskusie: 25. apríla 2006 Predseda skúšobnej komisie: Prof. Dr. H. Sitzmann, prvý reportér: Prof. Dr. G. Eisenbrand, druhý spravodajca: prof. Dr. DR. D. Schrenk ďakujem profesorovi Dr. G. Eisenbrand a Dr. C. Janzowskému za poskytnutie témy a za návrhy a benevolentnú podporu počas doktorandského obdobia.

Obsah 5.5.2.1 Pridanie kyseliny askorbovej. 152 5.5.7.1 Závislosť od pH a reverzibilita. 154 5.5.8 ZHRNUTIE STABILITY PLYTHENOV 157 6 DISKUSIA A VÝHĽADY. 158 7 ZHRNUTIE. 168 8 ZOZNAM LITERATÚRY. 170 9 PRÍLOHA. I 9.1. ILUSTRÁCIE NEZOBRAZENÉ. I 9.2 CV. V 9.3 PREDKLADANIE PUBLIKÁCIÍ A PUBLIKÁTY. VI

Zoznam skratiek ph pk a PKA PKC PKZ Plt Plz Que, QQ - Qq ra (p) e RS RP RT Rut SD SE SGLT1 SD SRB SSA SSB SULT TAC TBARS TEAC TCA TEA tgsh TI% TNB TRAP Tris UDPGT UDP VdF Logaritmus koncentrácie vodíkových iónov Logaritmus Kyselinová disociačná konštanta proteínová kináza A Proteínová kináza C primárne (ľudské) bunky hrubého čreva flóretín flididín kvercetín kvercetín-o-semichinón kvercetínchinón rekonštituované zmesi jablkového džúsu (výliskov) extrakte reaktívnych druhov kyslíka, angl. pre reaktívne formy kyslíka reverzná fáza retenčný čas rutín štandardná odchýlka pre štandardnú odchýlku štandardná chyba pre štandardnú chybu sodíkovo závislý transportér glukózy superoxid dismutáza sulforosamín B kyselina sulfosalicylová jednovláknová zlom, angl. pre zlom jedného vlákna fenol sulfát transferáza celková antioxidačná kapacita reaktívne látky s kyselinou tiobarbiturovou Trolox ekvivalentná antioxidačná kapacita kyselina trichlóroctová trietanolamín celkový glutatión Intenzita chvosta, angl. pre intenzitu chvosta 5-tio-2-nitrobenzoát celkový potenciál zachytávania peroxylových radikálov tris (hydroxymetyl) aminoetán UDP-glukuronyltransferáza uracildifosfát Združenie nemeckého priemyslu ovocných štiav e.v.

Teoretickým základom je možné zabrániť vhodnou stravou a životným štýlom [Donaldson, 2004]. Molekulárne mechanizmy karcinogenézy hrubého čreva Karcinogenéza je viacstupňový proces, ktorý zahŕňa molekulárne a bunkové zmeny. Proces možno rozdeliť do troch prepojených etáp: Iniciácia nádoru, podpora, progresia (Obrázok 3.3). I N I T I A T I N P R M T I N normálna bunková mutácia génov regulujúcich rast: APC, K-ras atď. Iniciovala selekciu buniek rast iniciovaných buniek aberantná mutácia ložísk krypt, delécia DCC, p53 spôsobuje endogénny FAP, HNPCC genotox. Substráty Vírusy RS mediátory zápalu Tkanivové poškodenie, CU, MC Adenóm P R G R E S S I N Selekcia Metastázy invázie karcinómu Obrázok 3.3: Viacstupňový proces vývoja rakoviny hrubého čreva, modifikovaný podľa [Schulte-Hermann et al., 2004]; Skratky: APC: adenomatózna polypóza coli; FAP: syndróm rodinnej adenomatóznej polypózy; HNPCC: syndróm nepolypózneho kolorektálneho karcinómu; CU: ulcerózna kolitída; MC: Crohnova choroba; DCC: vypustené pri rakovine hrubého čreva 9

Teoretické princípy Pri vysokej konzumácii bielkovín dochádza k zvýšenému prenosu bielkovín, peptidov a močoviny do hrubého čreva. Bakteriálny metabolizmus okrem iného produkuje amónny katión (NH + 4). Toto je cytotoxické pri pokusoch na zvieratách a môže hrať úlohu pri karcinogenéze. [Biesalski, 1999] 12

Teoretické základy NADP + NADPH FAD červená FAD ox lipidová peroxidácia chinón semichinón radikál redox cyklická inaktivácia enzýmu H Haber-Weissova reakcia 2 poškodenie DNA Fe Fentonova reakcia Fe 2 - H 2 2 SD 2 2 CAT GSH NADP + GPx GSR H 2 GSSG NADPH Obrázok 3.4: Príklady vývoja rôznych RS, obranných mechanizmov a poškodenia (zelená: detoxikácia, červená: priame následky reakcií RS; upravené z [Kelly a kol., 1998, Sies, 1985]; CAT: kataláza, GSH: znížený glutatión, GSSG: oxidovaný glutatión, GPx: glutatiónperoxidáza, GSR: glutatiónreduktáza, SD: superoxiddismutáza, CYP: monooxygenázy závislé od cytochrómu P450 Hydroxylový radikál H pôsobí ako najreaktívnejší druh kyslíka [Sies, 1991] so štandardným redukčným potenciálom 2,31 V silne oxidujúcim [ Halliwell a Gutteridge, 1999] .H môže vzniknúť v mnohých biologicky relevantných systémoch, napríklad prostredníctvom Haber-Weissovej reakcie katalyzovanej iónmi ťažkých kovov (napr. S meďou alebo železom - ekv. 3.7) z 2 a H2 2. Parciálna reakcia katalyzovaná iónmi železa je tiež známa ako Fentonova reakcia (ekv. 3.6) [Eisenbrand a Metzler, 2005]. 2 - + Fe 3+ 2 + Fe 2+ (3,5) Fe 2+ + H 2 2 H + H - + Fe 3+ (3,6) 2 - + H2 2 H + H - + 2 (3,7) 14

Teoretické základy 3.3. Oxidačný stres a jeho dôsledky 3.3.1 Peroxidácia lipidov (LP) Dôležitá úloha lipidov v bunkových zložkách podčiarkuje dôležitosť ich možného poškodenia oxidáciou v biologických systémoch. Táto oxidačná reakcia, známa tiež ako reťazová reakcia LP, je rozdelená do troch fáz: iniciácia, šírenie, ukončenie a je schematicky znázornená na obrázku 3.5. LH R RH Iniciácia LH L 2 LH Predĺženie reťazca L X Ukončenie stabilného produktu Obrázok 3.5: Prehľad LP, podľa [Kelly et al., 1998]; LH: mastná kyselina; R: reaktívne druhy; X: molekula, s ktorou L reaguje. Reťazovú reakciu zahájia reaktívne látky, ktoré môžu odoberať atóm vodíka z metylénovej skupiny (iniciovanie). H zahajuje reťazové reakcie so všetkými mastnými kyselinami, zatiaľ čo 2 reaguje iba s niektorými zvlášť aktivovanými mastnými kyselinami [Halliwell a Gutteridge, 1999]. Tak vznikajú alkylové a peroxylové radikály, ktoré potom reagujú s inými mastnými kyselinami. Radikálna reťazová reakcia sa vetví rozkladom peroxidov, z ktorých každý vznikne (šírenie) dva radikály. K prerušeniu reťazca dôjde reakciou radikálov s molekulami, ktoré tvoria stabilné produkty (terminácia). [Belitz a kol., 2001, Kelly a kol., 1998] 17

Teoretické základy Ideálnym substrátom pre LP sú polynenasýtené mastné kyseliny s bisalylickými metylénovými skupinami. V týchto polohách majú väzby uhlík-vodík nízke disociačné energie, takže je ľahko možný odber vodíka radikálnymi reakciami. [Kelly et al., 1998] Peroxidácia lipidov a s nimi spojená fragmentácia vedie k širokej škále nasýtených a nenasýtených molekúl, napr. Alkány, aldehydy, ketóny a furány [Belitz a kol., 2001]. Okrem vlastností ako aromatické zložky môžu mať tieto reaktívne molekuly aj cytotoxické, genotoxické a mutagénne účinky [Marnett, 1999]. Tvorba malondialdehydu (MDA) by sa mala vysvetliť ako príklad produktu LP: R2, 2 RH CCH 3 predĺženie reťazca CCH 3 cyklizácia CCH 3 2, RH R CCH 3 H zahrievanie, H + CCH 3 fragmentácia malondialdehydu + H CCH 3 Obrázok 3.6: Tvorba malondialdehydu (MDA) z kyseliny a-linolénovej podľa [Belitz et al., 2001] MDA sa tvorí z polynenasýtených mastných kyselín reakciou s peroxylovým zvyškom, kyslíkom, následnou cyklizáciou a fragmentáciou (obrázok 18)

Teoretické princípy NH 2 NH 2 HN NHNNNNNH 2 NNHHNNHNNH 8-hydroxyguanín 2-hydroxyadenín 8-xyadenín HN NH CH 3 HHH HN NHHHNH 2 HN HNN NH 2 CH tymín glykol 5- (hydroxymetyl) uracil 2,6-diamino-4-hydroxy- 5-formamidopyridín Obrázok 3.7: Príklady oxidovaných pyrimidínov a purínov podľa [Meneghini, 1997]. Útok D môže mať za následok rôzne výrobky, napr. Oxidácia guanínu v polohe 4, 5 alebo 8 (8-xo-deoxyguanín alebo 8-hydroxydesoxyguanín, 8-H-dG) purínového kruhu, čo vedie k produktom otvoreným v kruhu, ako je 2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidín ( FaPy) naďalej reagujú (obrázok 3.8). Útok na pyrimidíny môže viesť aj k dimérom báz. [Halliwell a Gutteridge, 1999, Jaruga a Dizdaroglu, 1996, Kelly a kol., 1998] HN NH2 NNNR deoxyguanínová xidácia H redukcia NH 2 HN NNNR otvorenie kruhu NH2 HN NNNRHH 8 HG NH 2 HN NCNNRHH + e -, + H + + e -, + H + + e -, + H + NH 2 HN NN NH R Otváranie kruhu NH 2 HN NNNRHHNH 2 HN NNNRH FaPy 8-H-dG Obrázok 3.8: Modifikácie deoxyguanínu radikálmi H, podľa [Halliwell a Gutteridge, 1999] 20

Teoretické základy Oprava DNA Systémy na opravu DNA rozpoznávajú upravené a nezodpovedajúce základy DNA. Takými modifikáciami sú hlavne oxidované bázy [Christmann et al., 2003]. Keď je poškodená báza rozpoznaná a vyrezaná DNA glykozylázou, vytvoria sa takzvané miesta apurín/apyrimidín (AP) a uvedie sa do pohybu opravná kaskáda opravy základnou excíziou (BER), najdôležitejšieho opravného systému pre poškodenie oxidačného DNA ( Obrázok 3.11). DNA glykozyláza AP lyáza DNA glykozyláza AP lyáza APE1 APE1 Pol δ/e Polp Polp Fen-1/PCNA Polp Lig1 Lig3 Obrázok 3.11: schematické znázornenie BER podľa [Scharer, 2003]; zelená: krátka nášivka - cesta, fialová dlhá cesta; Skratky v texte. AP endonukleáza-1 (APE1) hydrolyzuje fosfátovú väzbu na 5 strane abázických miest. Polymeráza β (Polp) vloží nukleotid v poradí do abázického miesta a potom abazické miesto odstráni vďaka svojej aktivite AP lyázy. DNA ligáza III (Lig3) uzatvára nick a obnovuje tak pôvodnú sekvenciu DNA. Ak je BER spôsobené bifunkčnými DNA glykozylázami/APLyázami25

Teoretická poloha [Manach et al., 2004]. Okrem toho sú tiež možné vetvy a väzby s inými ako flavonoidmi. Proantokyanidíny prispievajú k horkej a adstringentnej chuti v rastlinných potravinách [Jorgensen et al., 2004]. U jablčných muštov je stupeň polymerizácie hlavne medzi štyrmi a jedenástimi jednotkami flavanolu [Manach et al., 2004]. 3.4.1.2 Deriváty flóretínu Floretín a jeho glykozidy (hlavne phloretin-2-glukozid = phloridzin a phloretin-2 -xyloglucoside) patria medzi dihydrochalkóny, ich štruktúra je znázornená na obrázku 3.13. H H H R R = H: phloretin R = glukóza: phloridzin Obrázok 3.13: Štruktúra phloretinu a phloridzinu Prirodzene sa vyskytujú takmer výlučne v jablkách, ako aj v listoch a kôre jabloní. Ďalším východiskovým bodom pre fletetín je mikrobiálny rozklad apigenínu v hrubom čreve (kapitola 3.4.4). 3.4.1.3 Deriváty kyseliny hydroxyškoricovej Jednou z najbežnejších kyselín hydroxyškoricovej je kyselina kávová, ktorá sa v prírode zvyčajne nachádza esterifikovaná kyselinou chinovou alebo glukózou. Kyselina 5-kofeoylchinová je tiež známa pod menom kyselina chlorogénová (obrázok 3.14). 30

Teoretické princípy HHRR = H: kyselina kávová R = kyselina chinová (C5): kyselina chlorogénová HH 4 5 2 3 1 6 HH kyselina chinová CH Obrázok 3.14: Štruktúry kyseliny kávovej a kyseliny chlorogénnej podľa [Belitz et al., 2001] Kyselina chlorogénna sa nachádza hlavne v káve a jablkách, ale aj v iných jadierkach a kôstkovinách [Belitz a kol., 2001, Iwai a kol., 2004]. V silnej káve je možné dosiahnuť hladiny až 500 - 800 mg/l [lthof et al., 2003]. Osoby, ktoré nepijú kávu, prijímajú až 100 mg kyseliny chlorogénovej denne, osoby, ktoré kávu pijú, naopak, 500 - 1 000 mg/d [Lthof a kol., 2001]. 3.4.2 Absorpcia Pretože fenolovým zlúčeninám sa pripisujú bioaktívne účinky in vivo, je nevyhnutnou podmienkou absorpcia v tenkom čreve. Obrázok 3.15 znázorňuje možné cesty polyfenolov z potravy v gastrointestinálnom trakte. Polyfenoly Polfenoly Tkanivo Tenké črevo Pečeň Dvojbodka Žlč Obličky Obličky Moč Obrázok 3.15: Možné cesty polyfenolov u ľudí podľa [Scalbert a Williamson, 2000] Rozsah a mechanizmus absorpcie sú kontroverzné (tabuľka 3.3). 31

Teoretické princípy Tabuľka 3.3: Výber štúdií in vivo a in vitro na absorpciu derivátov kvercetínu Štúdia Látka Príjem Metabolity Literatúra Pacienti s ileostómiou Kvercetín 1 glykozidy Cibula Rutín 24% 52% 17% [Hollman et al., 1995] Subjekty testu (plazma nad 24 h) Glykozidy cibuľa rutín glykozidy jablko