Syndróm materskej fenylketonúrie Štúdie na myšiach naznačujú možný prístup pre jednu z nich

  • predmetov
  • abstraktné
  • pozadie
  • Metódy
  • Výsledky
  • Záver
  • Hlavná
  • Metódy
  • Spätné klinické preskúmanie záznamov
  • Zvieratá, starostlivosť a postupy
  • PEGylovaná rekombinantná Phe amoniakálna lyáza
  • Stanovenie Phe
  • Analýza aminokyselín
  • Farmakodynamické modelovanie
  • Výsledky
  • Materská PKU: University of Florida College of Medicine Experience
  • Pegvaliase a myš PKU
  • diskusia
  • Ďalšie informácie
  • Wordové dokumenty
  • Ďalšie informácie
  • Doplnkové metódy
  • Doplnkový obrázok S1
  • Doplnkový obrázok S2
  • Doplnková tabuľka S1
  • Súbory programu Excel
  • Doplnkové tabuľky

predmetov

  • Biologická terapia
  • Endokrinný systém a metabolické choroby
  • Pediatrický výskum
  • Priebeh tehotenstva

abstraktné

pozadie

Neliečená fenylketonúria (PKU), jedno z najbežnejších genetických ochorení u ľudí, zvyčajne vedie k mentálnemu postihnutiu. Aj keď umelé diéty obmedzené na bielkoviny môžu zabrániť oneskoreniu, dodržiavanie diéty je u dospelých často zlé. U tehotných žien s PKU môže nedodržiavanie predpisov viesť k syndrómu PKU u matky, pri ktorom vysoké hladiny fenylalanínu (Phe) spôsobujú závažné komplikácie plodu. Enzýmová substitučná terapia s Phe amoniaklyázou (PAL) koriguje PKU u mutantných myší BTBR Phe hydroxylázy (Pah enu2), čo naznačuje možnú liečbu materského PKU syndrómu u ľudí.

Metódy

Preverili sme klinické údaje, aby sme vyhodnotili incidenciu materského PKU syndrómu u tehotných PKU žien. Ošetrili sme samice myší PKU (na normálnej strave) pomocou PAL, stabilizovali sme Phe na fyziologických úrovniach a spojili sme ich s cieľom vyhodnotiť výsledky gravidity.

Výsledky

Lekárske záznamy ukazujú, že účinnosť diéty na prevenciu syndrómu PKU u matky sa, bohužiaľ, významne nezlepšila, pretože problém sa objavil pred 40 rokmi. Liečba PAL u gravidných myší PKU ukazuje, že potomstvo matiek liečených PAL prežíva až do dospelosti na rozdiel od celkovej letality pozorovanej u neliečených myší alebo zníženej miery prežitia u myší na diéte PKU.

Záver

Liečba PAL znížila závažnosť materského PKU syndrómu u myší a môže mať vplyv na liečbu ľudským PKU.

Na vyvíjajúci sa plod u matiek so slabo kontrolovanou PKU môže mať nepriaznivý vplyv intrauterinná expozícia zvýšeným hladinám Phe. V rámci spoločnej štúdie o fenylketonúrii u matiek sa zistilo, že zvýšené hladiny Phe v krvi matky sú teratogénne (5, 6, 7, 8, 9). Deti s materským syndrómom PKU trpia mikrocefáliou, kraniofaciálnym dysmorfizmom, nízkou pôrodnou hmotnosťou, vrodenými srdcovými chorobami, oneskorením vývoja a mentálnym postihnutím (10, 11, 12). V roku 1980 malo z 524 tehotenstiev u 155 žien 95% matiek s koncentráciou Phe v krvi ≥ 1 200 μM najmenej jedno mentálne postihnuté dieťa (13). Výskyt mentálneho postihnutia, mikrocefálie a vrodených srdcových chorôb bol oveľa častejší ako u bežnej populácie a koreloval s koncentráciami Phe v krvi matky.

Myš PKU je zavedeným modelom pre ľudskú PKU a má klinické charakteristiky podobné ako u pacientov s PKU, vrátane hyperfenylalalanémie (základné plazmatické koncentrácie Phe 1 000 až 2 000 μM), hypopigmentácie, kognitívnych porúch, audiogénnych záchvatov a syndrómu PKU u matky. (21, 22). . V predchádzajúcich štúdiách jediné týždenné subkutánne podanie pegvalázy v dávkach 80 mg/kg samcom myší PKU znížilo plazmatické hladiny Phe o ≤ 1 200 μM u enu2 nosných myší (HET) a homozygotného BTBR po dobu až 10 mesiacov Myši Pahenu2 Mutant (PKU) (21) boli pôvodne z Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Všetky protokoly boli schválené IACUC na Floridskej univerzite. Myšiam bolo prerušené liečenie pegvalázou a pegvaláza bola injikovaná subkutánne do oblasti hornej časti chrbta a dolnej časti krku. Plazmatický Phe sa získal z 45. 1 vzorka krvi odobratá v heparinizovanej mikrokapilárnej skúmavke.

PEGylovaná rekombinantná Phe amoniakálna lyáza

PEGylovaná, rekombinantná forma pegvaliázy Anabaena variabilis bola poskytnutá spoločnosťou BioMarin Pharmaceutical (Novato, CA). Sterilný roztok 10 mg/ml (

12 IU/ml) pegvaliáza sa zriedila týždenne na 5 mg/ml a skladovala sa pri 0 ° C. V závislosti od požadovanej dávky sa alikvotné časti zriedili na 0,5–2,0 mg/ml a vstreklo sa im 10 μl/g telesnej hmotnosti.

Stanovenie Phe

Plazmatický Phe sa stanovil pomocou fluorometrického testu (24), ktorý bol rozsiahlo modifikovaný pre malé objemy, rýchle časy obrátok a formát mikrotitračnej doštičky. Plazma zo vzoriek krvi bola až do stanovenia zmrazená. Alikvotná časť (7,5 ul) každej vzorky plazmy sa zbavila proteínov, umiestnila sa na 96-jamkovú doštičku pre PCR s testovacím kokteilom a inkubovala sa 2 hodiny pri 60 ° C. Do každej jamky 0,5 ml 96-jamkovej čiernej fluorimetrickej doštičky (Nunc, Roskilde, Dánsko, rozhodujúce pre presné stanovenie plazmy Phe) sa pridalo medené činidlo a pridali sa inkubované vzorky plazmy. Doštička bola na čítačke doštičiek SpectraMax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) s excitačnými parametrami: 378 nm; Emisie: 512 nm.

Analýza aminokyselín

Jednotlivé aminokyseliny a štandardy (Sigma) a činidlá vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (Fisher) boli získané od Sigma Chemical (St. Louis, MO) a Fisher Scientific (Atlanta, GA). Vzorky plazmy boli deproteinizované a bol pridaný norleucín ako vnútorný štandard. Vysušené vzorky boli derivatizované fenyltiokarbamylmi, vákuovo sušené, prebytočné činidlo bolo odstránené a chromatografované na Beckman System Gold LC s detektorom UV-VIS (254 nm) a analytickou kolónou Phenomenex s reverznou fázou C18. Koncentrácie aminokyselín sa vypočítali pomocou plôch píkov štandard/vnútorný štandard v porovnaní s plochami píkov vzoriek.

Farmakodynamické modelovanie

Farmakokinetické parametre boli stanovené z farmakokinetických/farmakodynamických štúdií s jednou dávkou (Musson a Laipis, údaje nie sú uvedené) u naivných myší. Plazmatické vzorky boli analyzované na hladinu pegvalázy pomocou BioMarin Pharmaceutical s použitím pegvaliase-špecifického sendvičového enzýmu spojeného imunosorbentu. Viazaná pegvaláza bola detegovaná pomocou anti-PEG protilátky. Medza kvantifikácie bola 60 ng/ml. Plazmatické hladiny Phe sa stanovili tak, ako je opísané vyššie. Plazmatické koncentrácie Phe v plazme pri rôznych režimoch dávkovania pegvalázy boli modelované pomocou softvéru WinNonlin verzie 5.2 (Certara, Princeton, NJ, USA).

Výsledky

Materská PKU: University of Florida College of Medicine Experience

Vysoká škola medicíny na Floridskej univerzite, odbor pediatrie, klinická genetika a metabolizmus, obsluhuje oblasť severnej Floridy od Pensacoly po Jacksonville po Orlando. Jedná sa o univerzitné lekárske stredisko, ktoré lieči väčšinu pacientov s PKU v oblasti ich porúch. Tehotné ženy s PKU dostávajú prenatálne poradenstvo a intenzívnu výživovú terapiu kvôli rizikám pre plod. Aj keď vzdialenosť od centra spôsobuje, že pravidelné návštevy sú pre mnohých pacientov nepohodlné, neustále sa im odporúča diéta a vyžaduje sa od nich týždenné podávanie hodnôt Phe v krvi a telesnej hmotnosti. Naše odporúčania pre tehotné (a pravdepodobne tehotné) ženy s PKU sú udržiavanie hladín Phe v krvi medzi 120 a 240 μM a Tyr nad 50 μM, dodržiavanie odporúčaného príjmu živín pre tehotenstvo a podpora primeraného prírastku hmotnosti.

Spätne sme skúmali záznamy o 28 tehotenstvách medzi rokmi 1996 a 2010. Pacienti boli rozdelení do troch skupín:

Skupina 1: Vynikajúca kontrola Phe (3/28) - Priemerné hodnoty Phe v krvi počas tehotenstva boli pod 360 μM, s maximálnymi hodnotami pod 420 μM Phe v ktoromkoľvek okamihu a najmenej šesť hodnôt Phe zaznamenaných v prvom trimestri.

Skupina 2: Hraničná kontrola Phe (11/28) - priemerné hladiny Phe v krvi boli pod 420 µ v prvom trimestri M a potom v druhom a treťom trimestri priemerne pod 360 µ. M. Pacienti s počiatočnou plazmatickou hodnotou Phe 700 μM alebo menej v prvom trimestri a dvoma alebo menšími hodnotami nad 500 μM počas zvyšku tehotenstva.

Skupina 3: Neadekvátna kontrola Phe (14/28) - priemerné plazmatické hladiny Phe boli nad 420 μM v prvom trimestri, s priemermi nad 360 μM počas zvyšku tehotenstva a/alebo s viacerými hodnotami nad 420 μM.

Priemerné hodnoty Phe za 40 týždňov tehotenstva pre tri kohorty pacientov sú uvedené na online doplnkovom obrázku S1. Výsledok každého tehotenstva, klasifikovaného ako normálne alebo postihnuté, na základe pôrodných parametrov (hmotnosť, výška, obvod hlavy), dostupných údajov z klinických vyšetrení a prítomnosti stavov súvisiacich s materským PKU syndrómom, je zhrnutý v doplnkovej tabuľke S1. Medzi skupinami sú zreteľné rozdiely (absolútna hodnota Phe, dosiahnutá úroveň kontroly, maximálne hodnoty Phe zaznamenané počas každého časového intervalu a výsledky tehotenstva); Podrobný popis každej skupiny sa nachádza v súbore „Doplnkové klinické výsledky“.

Pegvaliase a myš PKU

Na vyhodnotenie potenciálneho terapeutického prínosu pegvaliazy pri liečbe gravidných žien s PKU a ich plodov ohrozených materským PKU sme skúmali jeho účinky na materský PKU syndróm u samíc myší s PKU pomocou rôznych dávok a liečebných režimov. Výsledky našich štúdií sú zhrnuté v tabuľke 1; Podrobné výsledky pre každú štúdiu sú uvedené v doplnkovej tabuľke S2. Poznamenávame tu, že materský PKU syndróm je významne závažnejší u PKU myší ako u ľudských PKU pacientov. Obvyklým výsledkom je úplná smrť novorodenca v priebehu prvých 24 hodín života (21). Ďalej, aj keď Phe-obmedzená strava môže čiastočne korigovať materský PKU syndróm u PKU myší, pár šteniat prežije odstavenie od nízko-Phe diéty (21).

50 g a príjem potravy bude viac ako dvojnásobný. Príjem potravy sa po narodení vráti do normálu, ale počas dojčenia sa opäť zvyšuje, pretože dojčiaca matka kŕmi 40 až 50 g šteniat 14 dní po narodení, keď šteniatka začnú skúšať tuhú stravu. Tieto faktory naznačovali, že rozvrhy dávkovania dvakrát týždenne používané u dospelých negravidných myší nedokázali adekvátne udržať stabilné fyziologické hladiny Phe počas tehotenstva.

Spočiatku sme mali podozrenie, že hladiny Phe v plazme matky v štúdii 08-005 mohli dosiahnuť extrémne hodnoty, ktoré boli príliš nízke aj príliš vysoké na prežitie mláďat, ako napríklad štúdia obmedzenej stravy Phe a krátka štúdia pegvalázy. Polčas rozpadu (21, 23). V súlade s tým bolo osem samíc myší PKU (štúdia 08-027) postupne liečených protokolmi pegvalázy vyvinutými pomocou farmakodynamického modelovania, aby sa dosiahli priemerné hladiny Phe v plazme 250 ug. M pri 4 ul M (tabuľka 1 a doplnková tabuľka S2). Aj keď výsledný protokol (pondelok, streda, 10 mg/kg; piatok, 20 mg/kg) viedol k vynikajúcej fyzickej kondícii a predĺženiu životnosti, veľkosť vrhu a počet živých mláďat sa zvýšila len mierne (priemerná veľkosť vrhu 6 (2 vrhy) z 10) šteniatka pri narodení); 32% gravidných odstavených šteniat). Tieto ženy boli v čase párenia významne staršie kvôli úpravám protokolu potrebným na dosiahnutie požadovanej hladiny Phe v plazme (PM 1) (tabuľka 1).

V tretej štúdii (09-068a) bolo 12 samíc myší PKU liečených mierne odlišným dávkovacím režimom (10 mg/kg pegvalázy, pondelok 8:00; streda, piatok 16:00), čím farmakodynamické modelovanie viedlo aj k jednotnej plazme Phe by mal poskytovať kontrolu (obrázok 1 a tabuľka 1). Okrem toho sa vzorky plazmy odobrali o 8:00 namiesto 16:00. Týchto 12 PKU myší malo v priemere 300 ug. Hladina M Phe pri 4 µ M, čo naznačuje dobrú kontrolu hladín Phe počas týždňa, ako sa predpovedalo farmakodynamickým modelovaním. Avšak hodnoty vo vzorkách krvi 8-AM boli dramaticky zvýšené (obrázok 1). Tieto ženy sa počas tohto dávkovacieho protokolu spárili a mali celkovo 39 tehotenstiev (tabuľka 1, doplnková tabuľka S2). Len niečo cez 50% z týchto tehotenstiev odstavilo šteniatka, s priemernou veľkosťou vrhu okolo šiestich šteniat (päť vrhov po osem alebo viac šteniat), čo je lepšie ako predchádzajúce výsledky.

fenylketonúrie

Denné zmeny plazmatických hladín fenylalanínu (Phe) u myší liečených fenylketonúriou (PKU) liečených pegvalázou. Dvanástim samiciam myší PKU (štúdia 09-068a) bola subkutánne injikovaná 10 mg/kg pegvalázy trikrát týždenne (pondelok, 8:00; streda, 16:00; piatok, 16:00; ↓). Farmakodynamické modelovanie tohto dávkového plánu (▪ •••) predpovedalo dobrú reguláciu plazmatických hladín Phe. Vzorky krvi (40 ul) sa odoberali o 8:00 a 16:00 v rôzne dni v týždni po dobu 7 týždňov a priemerne sa dosiahli plazmafové hladiny, aby sa získal kombinovaný týždenný graf hladín plazmafu (O). Hlavné značky hash pre os x predstavujú dni v týždni (12:00) a sekundárne značky hash pre 8:00 a 16:00 Zložené údaje od neošetrených samíc myší PKU (2, •) sa opakovali sedemkrát, aby sa preukázala maximálna zhoda s týždennými údajmi Phe v plazme z liečby pegvalázou. Vrcholy plazmatického Phe sa vyskytujú u liečených zvierat v časoch, ktoré zodpovedajú maximálnym hladinám Phe v plazme u neošetrených myší PKU, aj keď výrazné zníženie hodnôt Phe v plazme 8-AM v dňoch po podaní pegvalázy Pozoruje sa dávka.

myšiach

Denné zmeny plazmatických hladín fenylalanínu (Phe) u neošetrených samíc myší s fenylketonúriou (PKU). Zmena plazmatických hladín Phe, ku ktorým došlo počas 24 hodinového cyklu tmavého svetla, sa určila z analýzy zložených údajov. Vzorky krvi (40 ul) boli odobraté šiestim dospelým samiciam myší PKU v uvedených časoch, pričom vzorky boli odobraté po dobu 9 týždňov, aby sa zabránilo stresu v dôsledku straty krvi. Z každého zvieraťa sa v každom časovom bode odobrali dve vzorky. Výsledky plazmy Phe sa skombinovali a spriemerovali, čím sa získal 24-hodinový záznam zložených údajov. Graf ukazuje rýchle zvýšenie plazmy Phe o viac ako 1 000 μM, ku ktorému došlo, keď sa myši zobudili o 18:00 a začali sa kŕmiť, a pomalší pokles od začiatku svetelného cyklu o 6:00.

naznačujú

Ďalším faktorom by mohla byť ovplyvnená liečba materského PKU syndrómu pegvalázou. U neošetreného ľudského PKU je pomer Tyr k Phe často znížený, pričom pozorované plazmatické hladiny Tyr sú znížené na 50% hodnôt pozorovaných u normálnych kontrol (25). Merali sme hladiny Trp, Tyr a Phe u myší PKU ošetrených WT, PKU a pegvalázou pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (obrázok 4). Rovnako ako u pacientov s ľudským PKU boli plazmatické hladiny Tyr u PKU myší znížené z normálnych hladín bez akejkoľvek zmeny v hladinách Trp. Zníženie plazmatických hladín Phe na fyziologické alebo subfyziologické hladiny pomocou pegvalázy nemalo žiadny vplyv na plazmatický Tyr. Pokusy o zvýšenie hladín Tyr u myši PKU liečenej pegvalázou pridaním Tyru do pitnej vody boli neúspešné kvôli jeho slabej rozpustnosti. Preto je na stanovenie možnej úlohy nízkeho Tyr pri čiastočnej odpovedi na syndróm PKU u matky u PKU potrebné použitie umelej stravy s pridaným Tyrom (kde nízka rozpustnosť neobmedzuje potenciálne vychytávanie).

naznačujú

Hladiny aromatických aminokyselín v plazme samíc myší divokého typu (WT) a fenylketonúrie (PKU). Plazmatické vzorky získané z neošetrených myší WT a PKU a myší PKU ošetrených pegvalázou sa analyzovali separáciou pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Vzorky plazmy od neošetrených myší PKU vykazujú významne zvýšenú plazmatickú hladinu fenylalanínu a o 40–50% nižšiu plazmatickú hladinu tyrozínu v porovnaní s WT myšami. Plazmatické hladiny tryptofánu zostali medzi dvoma genotypmi podobné. Liečba pegvalázou znížila plazmatický Phe na fyziologické alebo pod normálne fyziologické hodnoty v závislosti od dávkovacieho režimu. Hladiny tyrozínu a tryptofánu u neošetrených a pegvalázou ošetrených PKU myší boli podobné.

diskusia