Synergické použitie neurálnych prekurzorových buniek a samo-zhromažďujúcich sa peptidov v experimentálnej cervikálnej oblasti

Abstrakt

Úvod

Viac ako 50% poranení miechy krčnej chrbtice. V klinickej praxi sú popísané dva hlavné patofyziologické mechanizmy: počiatočné pomliaždenie miechy a následne prebiehajúce kompresné zlomeniny kostí, krvácanie alebo opuch tkaniva spôsobené.

Model zvierania/kompresie svorky aneuryzmy napodobňuje oba patofyziologické mechanizmy: prasknutím svorky sa vytvorí zovretie a trvanie svorky poskytuje kompresnú zložku, ktorá v klinickom prostredí spôsobuje kompresiu spôsobenú zlomeninami kostí, krvácaním alebo opuchom tkaniva, podstatne dlhšie. Použitá svorka aneuryzmy je zmenená krúžkovou pružinou, ktorá zaručuje presnú a reprodukovateľnú príchytnú silu. Najmä v porovnaní s hemi-transekčným alebo kontúznym modelom napodobňuje tento model klipu s aneuryzmou najlepšie klinické prostredie. Zatiaľ čo pacienti s poranením hrudníka trpia paraplégiou, väčšina pacientov s poranením krčka maternice je kvadruplegická a úplne závislá. Anatomická štruktúra krčnej drene sa však v porovnaní so štruktúrou hrudnej alebo driekovej chrbtice významne líši, a teda najmä v konkrétnom protokole.

Vývoj dreňových dutín a zjazvenie tkanív sú prekážkami obnovy a regenerácie. Na prekonanie týchto prekážok je použitie lešenárskeho materiálu sľubným prístupom. Samo-zhromažďujúce sa peptidy sa môžu injikovať priamo do epicentra lézie. Tam sú spojené do lešenia z nanovlákien premosťujúcich dutinu a zlepšujúcich inhibičné prostredie znižovaním zápalu a desenia tkanív. Zatiaľ čo tuhé materiály spôsobujú počas implantácie značné poškodenie miechy, tekuté peptidy je možné injikovať bezpečne a bez vážneho ďalšieho poškodenia.

Zlepšenie inhibičného prostredia pomocou samoorganizujúcich sa peptidov pred transplantáciou kmeňových buniek preto podporuje integráciu, diferenciáciu a nakoniec funkčné zotavenie buniek po poranení krčnej miechy.

Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

Protokol

POZNÁMKA: Nasledujúci experimentálny protokol bol schválený Výborom pre starostlivosť o zvieratá siete University Health Network (Toronto, Kanada) a je stanovený v súlade s usmerneniami v pokynoch pre starostlivosť a použitie experimentálnych zvierat vypracovaných Kanadskou radou pre starostlivosť o zvieratá. .

1. Model kontúzie/kompresie svorky krčnej aneuryzmy

2. Injekcia SAP a NPC (14 dní po zranení)

90% živých buniek v bunkovej suspenzii. Bunky sa zriedia v rastovom médiu (50 x 103 živých buniek/ul) a použijú sa na transplantáciu buniek.

  • Vykonajte štyri 2 μl (celkový objem 8 μl so 4 x 105 NPC) intraspinálne injekcie obojstranne 2 mm rostrálne a kaudálne od miesta poranenia. Po otvorení tvrdej pleny vložte Hamiltonovu mikroskopickú kapiláru 1,5 mm pod dorzálny povrch miechy a vstreknite 2 μl bunkovej suspenzie. Vyberte rýchlosť vstrekovania okolo 0,5 ml/min (min).
  • Na konci každej injekcie a pred vybratím kapiláry z kábla počkajte najmenej 1 minútu, aby sa tkanivo mohlo natiahnuť, aby sa prispôsobil novému objemu bunky. (Obrázok 2)

    • 3. Implantácia subdurálnych púmp na aplikáciu rastového faktora

    1. Na konci pozorovacieho obdobia (napr. 4 týždne po SCI) sa zvieratá usmrtia v hlbokej anestézii (5% izoflurán počas 2 - 3 minút) a transkardiálne ich prepláchnu 50 ml studeného (4 ° C) soľného roztoku, potom 150 ml studeného 4% Paraformaldehyd v 0,1 M fosfátom pufrovanom soľnom roztoku (PBS).
    2. Vyberte miechu a namočte ju na 24 hodín do 4% paraformaldehydu v 0,1 M fosfátom pufrovanom soľnom roztoku (PBS).
    3. Vložte miechu do 25% roztoku sacharózy na kryokonzerváciu na 48 hodín.
    4. Poskytnite pozdĺžne kryosekcie s hrúbkou Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Reprezentatívne výsledky

    Pri vykonávaní vyššie uvedeného postupu lešenie SAP premosťuje dutinu a poskytuje zlepšenie v inhibičnom prostredí, menšie zjazvenie tkanív a zvýšenie prežitia NPC, Obr ukazuje pozdĺžny rez miechou potkana v mieste poranenia získaného 6 týždňov po SCI a 4 týždne po injekcii QL6 SAP a transplantácii NPC. Peptidy QL6 boli úspešne injikované do drene, agregované v epicentre a difúzne rostrokaudálne v penumbre. Zobrazovanie elektrónovým mikroskopom sa ďalej ukazuje v Obrázok 5, kde usporiadanie 1% (hm./obj.) peptidov QL6 na lešení z nanovlákien sa zriedi v roztokoch PBS do 2 hodín.

    Táto matica poskytuje zlepšenie v inhibičnom prostredí so zvýšeným prežívaním a diferenciáciou buniek, menším zjazvením tkaniva a nakoniec vedie k lepšej príležitosti na funkčné obnovenie.

    ure 1 "src ="/files/ftp_upload/52.105/52105fig1highres.jpg "/>Obrázok 1: Model aneuryzmy kontúzie/kompresie klipu (A) Fotografie chirurgickým mikroskopom po laminektómii C7/T1 a kontúzii klipom/kompresiou miechy potkana (B) Zaručte obraz spony pomocou krúžkovej pružiny presný. Zatváracia sila.

    neurálnych
    Obrázok 2: Injekčné body SAP a kmeňových buniek Grafické znázornenie Injekčné body:. 2 stereotakticky vedené injekcie SAP do epicentra lézie, po ktorých nasledujú 4 injekcie NPC do susedných chrbtových stĺpov vo vzdialenosti 2 mm kaudálne a rostrálne od epicentra.

    neurálnych

    3: Subdurálny katéter na podávanie rastového faktora Fotografie pomocou chirurgického mikroskopu: (A) Implantované subdurálne katétre na zabezpečenie rastových faktorov. katéter je pripevnený niekoľkými 6,0 stehmi, kde sú pripevnené parazpálne svaly; malé otvorenie dury na C5; Subdurálne umiestnenie katétra s koncom katétra otvoreným v blízkosti lézie pri C7/T1. (B) Katéter pripojený k mikropumpe v subdurálnom výklenku pripevnenom k ​​bočnému boku.

    neurálnych
    Obrázok 4: Úspešné dodanie SAP a NPC do krčnej drene Fluorescenčné sfarbenie (pozadie DAPI, modré) pre pozdĺžny rez traumatizovanou miechou potkan. Značené SAP (QL6-FITC, zelené) sa agregovali v epicentre lézie. Injikované NPC (pozitívne DsRed, červené) sú v rozptýlenom rustálnom a kaudálnom smere. Mierka ukazuje 5 mm.

    použitie
    Obrázok 5: Tvorba rámca z nanovlákien Obrázok skenovacieho elektrónového mikroskopu (SEM) ukazuje nanovláknové lešenie namontovaných SAP. Stupnica sa vzťahuje na 1 um).

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Diskusia

    Tento protokol bol navrhnutý tak, aby čitateľovi umožnil vykonať model poranenia krku na potkanoch a aby použil kombinovaný liečebný prístup s SAP a NPC podporujúci lepšie zotavenie po SCI krku.

    Najmä v porovnaní s inými modelmi poranenia krčnej chrbtice, ako je napríklad model (hemi) -transekcie alebo modely chudnutia a otrasov, predstavuje model kontúzie/kompresie dvoma hlavnými patofyziologickými mechanizmami traumy - podliatinami a tlakom - a preto napodobňuje najlepšie klinické Podmienky. Aj keď bol nedávno použitý na použitie u potkanov a myší BWS 7-11, je vhodný na použitie v krčnej chrbtici. Bol to dôležitý krok, pretože poranenia krčnej miechy sú najčastejšie pozorované na klinike a anatómia krčka maternice sa výrazne líši od anatómie hrudnej chrbtice. Okrem toho sa krční SCI pacienti s tetraparézou snažia aspoň čiastočne obnoviť motorické pomazanie horných končatín.

    Boli identifikované samoskladajúce sa peptidy s potenciálom premosťovať dutinu a tiež zlepšovať inhibičné prostredie v mieste lézie, čo v konečnom dôsledku vedie dokonca k regenerácii axónov a pučaniu 5, 12,13,14. Nanovlákna QL-6 sa zhromažďujú, aby vytvorili lešenia premosťujúce dreňovú dutinu, a tak môžu poskytnúť matricu pre axonálne pučanie a regeneráciu a zlepšenie inhibičného prostredia pred transplantáciou buniek. Výhody týchto peptidov spočívajú v ich nízkej viskozite (tekutosť) a neutrálnom pH. Najmä v porovnaní s vysoko viskóznymi hydrogélmi alebo tkanivovými lešeniami sa dajú SAP ľahko vstreknúť do poranenej miechy a ďalšie poranenia odvodené zo samotnej injekcie sú obmedzené.

    Aj keď samotné nanovlákna QL6 môžu zlepšiť prežitie buniek 4,15, zdá sa, že použitie rastových faktorov je prospešné pre 16,17,18,19,20,21. Môžu byť podávané buď prostredníctvom rastových faktorov bez hydrogélov 22 alebo pomocou osmotických púmp (ako je opísané vyššie). Osmotické pumpy pripojené k subdurálnym katétrom majú výhodu kontinuálneho a riadeného uvoľňovania, a tým obohatenia tekutiny z krčnej miechy (CSF). Usporiadanie subdurálneho katétra je však náročné, najmä pokiaľ ide o veľké jazvy, ktoré sa vyskytli niekoľko týždňov po poranení.

    Na vytvorenie dobrých tkanivových podmienok pre prežitie a integráciu NPC niekoľko štúdií vybralo injekčné body v susednej bielej hmote, 2 mm rostrálne alebo kaudálne od lézie, a nie priamo v epicentre lézie 4,15,18. Tam majú NPC väčšie šance na prežitie, integráciu a diferenciáciu na astrocyty, oligodendrocyty a neuróny a môžu migrovať do lézie alebo do nej, čo vedie k pučaniu a zlepšeniu axonálnej konektivity.

    Po zvládnutí týchto techník môže tento navrhovaný protokol jednotlivý užívateľ prijať podľa svojich potrieb a záujmov, zmien úrovne a závažnosti poranenia, použitia rôznych typov buniek alebo rastových faktorov alebo v spojení s inými neuroochrannými látkami. .

    In Voids and Tissue Scarring: Stručne povedané, kombinovaná liečba s SAP a NPC môže ponúknuť nový a sľubný prístup k prekonávaniu najťažších prekážok pri liečbe SCI.

    Vyžaduje sa predplatné. Odporučte prosím JoVE svojmu knihovníkovi.

    Poďakovanie

    Radi by sme ocenili finančnú podporu pre túto prácu od Kanadských inštitútov zdravotného výskumu (CIHR), Nadácie pre rodinu Krembil, predsedu Halberta pre opravu a regeneráciu nervov, Phillipa a Peggy DeZwirekových a Gordona Yaa za príspevok 2. dňa Klausa Zweckbergera podporil grant od „Deutsche Forschungsgesellschaft“ (DFG).