Test otcovstva Anatómia a fyziológia
Test otcovstva je genetický test, ktorý určuje, či je jednotlivec biologickým otcom dieťaťa alebo nie. Genetický dôkaz otcovstva je veľmi užitočný, najmä v súdnom lekárstve. Existujú aj testy na materstvo, ktoré sa používajú oveľa menej, a to najmä v prípade materskej dovolenky, vraždenia novorodencov alebo adopcií. V minulosti sa na zistenie otcovstva používali rôzne metódy, napríklad analýza antigénu krvných skupín, analýza antigénu HLA, analýza antigénu leukocytov alebo analýza rôznych proteínov a enzýmov, všetky však neposkytli spoľahlivé výsledky.
Definícia testu otcovstva
Testom otcovstva je laboratórna analýza 16 sekvencií DNA umiestnených na rôznych chromozómoch s cieľom zistiť, či je jednotlivec biologickým otcom dieťaťa. Od údajného otca a dieťaťa sa požadujú biologické vzorky, ktoré analyzujú 16 markerov alebo sekvencie DNA od každého z nich, pričom analýza DNA je jediná, ktorá poskytuje istotu pri určovaní stupňa príbuzenstva. Vzorky získané od týchto dvoch jednotlivcov sa porovnajú analýzou každého markera osobitne a zistením komplementarity medzi markermi od dieťaťa a markermi od otca. Ak sa vzorky odoberajú aj od matky, zvýši sa stupeň špecifickosti testu, čo však nie je nevyhnutne potrebné, test má špecifickosť 99,9% a v prípade odberu dvoch vzoriek, jednej od predpokladaného otca a jednej od dieťa. Test je možné vykonať prenatálny aj postnatálny.
V Rumunsku sa náklady na test otcovstva pohybujú medzi 750 (testovaná matka, predpokladaný otec a 1 dieťa) a 1 500 RON (testovaná matka, dvaja predpokladaní otcovia a dve deti), v závislosti od testovacej metódy, odobratej biologickej vzorky a počet analyzovaných vzoriek.
Výsledok je k dispozícii do 3 - 7 pracovných dní od odoslania testov do laboratória, ale môže to trvať aj dlhšie, v závislosti od techniky použitej v laboratóriu, ktoré vykonáva analýzu.
Dá sa to aj určiť bratstvo (príbuzenstvo medzi 2 alebo viacerými deťmi) a určenie stupňa príbuzenstva medzi dieťaťom a rôznymi členmi rodiny (tety, strýkovia, starí rodičia). Môže tiež určiť profil DNA jednotlivca profil jadrovej DNA a tiež Mitochondriálna DNA ako aj Testovanie chromozómu Y za preukázanie príbuzenstva medzi mužmi (otcovské príbuzenstvo).
Testovanie dvojitej zygózy sa robí rovnakými metódami ako test otcovstva a môže určiť, či sú dvojčatá monozygotné (identické) alebo dizygotné.
Prenatálne testovanie
1. Amniocentéza.
2. Biopsia choriových klkov.
Umožňuje včasné testovanie, počnúc 10. - 13. týždňom tehotenstva. Zahŕňa odber malej časti placenty z maternice. Jedná sa o invazívny zákrok, ktorý je možné vykonať ultrazvukom transcervikálne (prístup z pošvy, prechod cez krčok maternice do maternice) alebo transabdominálne pomocou tenkej a tenkej ihly. Choriové vily sú výrastky jemného tkaniva v prste rukavice vyčnievajúce zo steny maternice. Majú genetický materiál identický s genetickým materiálom plodu. Komplikácie predstavuje po zákroku transvaginálne krvácanie a prasknutie placentárnych membrán. Na test je potrebné odobrať 2 - 3 mm tkaniva.
Amniocentéza aj biopsia choriových klkov sú rutinné testy, ktoré sa vykonávajú prenatálne nielen na zistenie otcovstva, ale aj na stanovenie abnormalít genetického materiálu a stanovenie diagnózy genetických chorôb a chromozomálnych abnormalít, čo je diagnóza, ktorú je možné zvoliť pri potrate. terapeutické). Biopsia choriových klkov má v tomto ohľade výhodu, pretože sa dá vykonať rýchlejšie, počnúc 13. týždňom tehotenstva. Zber, a to tak v prípade amniocentézy, ako aj v prípade biopsie choriových klkov, bude robiť iba gynekológ a iba pod vedením ultrazvuku.
3. SNP microarray (single nukleotid polymorphism microarray)
je neinvazívna technológia na určovanie otcovstva analýzou cirkulujúcej fetálnej DNA extrahovanej z krvi matky. Test sa môže vykonať počnúc 10. týždňom tehotenstva. Analyzuje sa fetálna DNA, materská DNA a DNA predpokladaného otca. Analyzuje sa 317 000 genetických markerov predstavovaných nukleotidmi a otcovstvo sa stanoví na základe ich komplementarity. Presnosť tohto testu je 99,9% a má tendenciu nahrádzať invazívne testy, ako je amniocentéza a biopsia choriových klkov.
Postnatálne testovanie
Povinné vzorky pre analýzu, ktorá sa má vykonať, sú vzorky odobraté od dieťaťa a predpokladaného otca. Nie je povinné testovať vzorku od matky, ale jej prítomnosť zvyšuje istotu výsledku a pravdepodobnosť potvrdenia otcovstva.
Skúšobné metódy
1. Reťazová polymerizačná reakcia
Technika PCR
Je to spôsob, ktorým sa DNA sekvencia amplifikuje in vitro. Prírodná DNA prechádza procesom replikácie alebo syntézy, pričom sa nová sekvencia DNA syntetizuje pomocou materskej sekvencie DNA, ktorá sa nazýva matrica. PCR vykonáva replikáciu DNA v laboratóriu. To vedie k väčšiemu množstvu danej sekvencie DNA, ktoré potom možno analyzovať. Pre reakciu sú potrebné:
- vzorky DNA, ktoré sa majú analyzovať (od predpokladaného otca, matky a dieťaťa), ktoré sa majú použiť (tzv. templátová DNA)
- DNA polymeráza
- priméry (oligonukleotidy)
- reakčný pufor
- Ióny horčíka
Reakcia zahrnuje tepelnú denaturáciu templátu DNA s uvoľnením dvojzávitnice, pripojením primerov a polymerizáciu. Na konci prvého polymerizačného cyklu (amplifikácie) sa získa dvojnásobné množstvo DNA v porovnaní s množstvom templátovej DNA. Uskutočňuje sa medzi 25 a 40 amplifikačnými cyklami. Minimálne množstvo templátovej DNA pre úspešnosť reakcie je 500 nanogramov jadrovej DNA. Použité priméry sú umelé a musia byť komplementárne k 5 'a 3' koncom oblasti DNA, ktorá sa má amplifikovať. DNA polymeráza použitá pre reagenty sa získava z termofilných mikroorganizmov a musí byť termostabilná, aby odolala teplotám, pri ktorých sa uskutočňuje polymerizačná reťazová reakcia (100 stupňov Celzia). Najčastejšie sa používa DNA polymeráza Taq, alebo Taq Pol, získané z mikroorganizmu Termus Aquaticus. Taq Pol odoláva všetkým trom teplotným krokom, pri ktorých sa uskutočňuje PCR, a to: 90 - 95 stupňov Celzia pre denaturáciu templátu DNA a odvíjanie dvojitej špirály, 55 - 60 stupňov pre pripojenie primérov ku každému z dvoch vlákien denaturovanej templátovej DNA a 72-75 stupňov pre polymeračnú reakciu.
Fázy reťazovej polymerizačnej reakcie:
a) Denaturácia dvojvláknovej DNA
Vyrába sa pri teplote nad 90 stupňov po dobu 20 - 30 sekúnd demontážou dvojvláknovej DNA do dvoch komplementárnych templátových vlákien, ku ktorým sa potom pripoja priméry. Preto na konci tohto kroku vzniknú v reakčnom médiu dva voľné jednovláknové reťazce DNA.
b) kopulácia jednovláknových primérov DNA
Trvá 20 - 40 sekúnd, počas ktorých sa teplota zníži na 55 - 60 stupňov. Výsledkom je hybridná dvojvláknová DNA.
c) Rozšírenie primérov
DNA polymeráza sa naviaže na hybridný dvojvláknový reťazec DNA prečítaním sekvencie templátového reťazca DNA a predĺži priméry na základe pravidla komplementarity medzi dusíkatými bázami.
Fázy zosilnenia:
- Exponenciálne zosilnenie - zdvojnásobenie množstva DNA na konci každého polymerizačného cyklu
- Vyrovnáva sa - Keď sa činidlá spotrebujú, reakcie budú prebiehať pomalšie
- PLATEAU - vyčerpanie činidiel
2. Polymorfizmus s obmedzením dĺžky fragmentu
Táto technika zahrnuje fragmentáciu sekvencie DNA pomocou a reštrikčné enzýmy. Výsledné fragmenty sa rozdelia podľa dĺžky pomocou agarovej gélovej elektroforézy a potom sa prevedú na špeciálnu membránu postupom Southern Blot. Všetky vzorky od matky, predpokladaného otca a dieťaťa sa analyzujú rovnakou metódou a porovnajú sa podľa komplementarity sekvencií DNA s rovnakou dĺžkou. Metóda RFLP sa považuje za zlatý štandard pre genotypizáciu, je však obmedzená skutočnosťou, že DNA vzoriek vstupujúcich do testu musí byť výnimočnej kvality, aby sa dala rozdeliť na fragmenty. Trvanie testu je tiež veľmi dlhé, pohybuje sa od 3 týždňov do 3 mesiacov, zatiaľ čo test PCR trvá 3 až 9 dní.
Test otcovstva predstavuje jediná metóda vylúčiť neistotu ohľadne založenia biologického otca dieťaťa, pričom ide o genetický test so 100% presnosťou pri eliminácii osôb, ktoré nezodpovedajú stavu biologického otca, a 99,9% presnosťou pri určovaní jednotlivca so statusom biologického otca. Výsledok sa zverejní asi týždeň po obdržaní vzoriek, ale aj v Rumunsku existujú laboratóriá, ktoré pracujú v núdzovom režime a výsledky zasielajú po 8 hodinách.