Tvorba chimérických myší s mutáciami v signálnej doméne CD22 a

Generácia chimérických myší s mutáciami v signálnej doméne CD22 a výskumy funkcie CD22 u knockoutovaných myší Dizertačná práca na získanie vedeckého doktorátu z bavorskej univerzity Juliusa Maximiliána vo Würzburgu, ktorú predložil Claus-Peter Danzer z Mannheim-Neckarau Würzburg, 2002

myší

Predložené: Členovia doktorskej komisie: Predseda: Recenzent: Dr. rer. nat. habil. Lars Nitschke Recenzent: Prof. Dr. rer. nat. Gert Pflugfelder Deň doktorandského kolokvia: Osvedčenie o doktorande rozdané dňa:

Vysvetlenie: Týmto prehlasujem, že som napísal dizertačnú prácu Generácia chimérických myší s mutáciami v signálnej doméne CD22 a vyšetrenia funkcie CD22 u knockoutovaných myší a že som nepoužil iné nástroje alebo zdroje ako tie, ktoré som uviedol. Tiež vyhlasujem, že táto dizertačná práca nebola predložená v žiadnom inom skúšobnom postupe, a to v rovnakej alebo v odlišnej podobe. Okrem titulov zdokumentovaných v žiadosti o prijatie som predtým nezískal ani nepokúšal o získanie ďalších akademických titulov. Würzburg, Claus-Peter Danzer

Táto práca sa uskutočnila od 15. januára 1998 do 31. januára 2002 na Inštitúte pre virológiu a imunobiológiu Bavorskej univerzity Juliusa Maximiliána vo Würzburgu pod vedením Dr. rer. nat. habil. Vyrobil Lars Nitschke.

IV 7.2 Zoznam publikácií. 111 7.2.1 Originálne práce z tejto dizertačnej práce. 111 7.2.2 Publikácie na kongresoch/stretnutiach. 111 8. Príloha. 113 8.1 Skratky. 113 8.2 Sekvencie primérov. 115 8.3 Vektorové mapy. 117 9. Životopis. 120

13 priehradka. Preto bolo dôvodné podozrenie, že počet MZ B buniek v CD22 -/- myšiach mohol byť znížený. Preto by sa mala skúmať veľkosť kompartmentu MZ B-buniek u myší CD22 -/- a dôsledky možného zníženia odpovede na antigény TI-2.: kyselina α2,6-sialová CD22-ITIM- KO CD22-Tailless Syk SOS? Grb-2 P Y- P Y- P Y- -F ITIM SHC Grb-2 SHIP Lyn PI3K PLCγ2 -F ITIM -F ITIM SH2 SH2 PTPáza SHP-1 Obr. 3: Dva plánované modely myší na štúdium signálnej transdukcie CD22 in vivo . Ľavá strana: CD22-ITIM-KO: Tyrozíny v ITIM mutovali na fenylalaníny. Očakáva sa, že proteín-tyrozín fosfatáza SHP-1 inhibujúca signál už nemôže interagovať s CD22 a môže sa tak aktivovať. Naproti tomu väzba pozitívnych modulátorov signálu B-buniek PLCy, Lyn, PI3K a Grb-2 bude stále možná. Je tiež možné viazať SHIP ako súčasť komplexu SHIP-Grb2-Shc. Pravá strana: CD22-Tailless: Stop kodón v exóne 12 vedie k expresii molekuly CD22 bez cytoplazmatickej domény. Tento model myši doplní CD22-ITIM-KO. Oba modely budú tiež slúžiť na objasnenie vzťahu medzi signálnou transdukciou a adhéznou funkciou CD22.

14 2.1 Materiály 2. Materiály a metódy 2.1.1 E. coliNM522 bakteriálne kmene: (F`lacIq (lacz) m15 proa + prob + (hsdms-mrcb) 5 (lac-proab) supe thi-1 lambda) pôvodne slúžil ako klonovací kmeň E. .coliDH5α: F- delta (laczya-argf) u169 phi80delta (lacz) m15 enda1 reca1 hsdr17 deor thi-1 supe44 gyra96 rela1 rpsl lambda- bol použitý ako štandardný klonovací kmeň v ďalšom priebehu tejto dizertačnej práce E. coliBNN132: enda1. supe96 supe96 delta (lac-proab) (F trad36 proa + prob + laciq delta (lacz) m15) lambdakc (kan-cre) sa použil na testovanie funkčnosti loxp sekvencií v použitých cieľových konštruktoch. E. coliJM110: F [trad36 proa + prob + laciq delta (lacz) m15] dam dcm supe44 hsdr17 thi leu thr rpsl krajkový galk ara tona tsx delta (lac-proab) lambda slúžil ako hostiteľský kmeň pre plazmidy, ktoré štiepili reštrikčnými endonukleázami citlivými na metyláciu by mala byť. 2.1.2 Chemikálie Pokiaľ nie je uvedené inak, laboratórne chemikálie boli od Roth (Karlsruhe) alebo Merck (Darmstadt). 2.1.3 Pufre a roztoky opakovane použité TE pufor 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, pH 8,0 PBS (fosfátový Soľný roztok) 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HP04, 0,24 g KH2P04, 0,133 g CaCl2 2H20, 0,1 g MgCl2 6H20 s HCl pufor ph7.2 FACS 1 x PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN3

36 loxp loxp pcd22-itim-ko tk neo 1112 13 14 15 zameraný na genóm. Locus loxp loxp tk neo rekombinovaný Locus Cre deletion loxp rec./ cre-delet. Locus exón 11-15 mutoval ITIM (YF) 1 kb Obrázok 6: Priebeh homológnej rekombinácie vektora pcd22-itim-ko s endogénnym lokusom CD22. Následná delécia selekčnej kazety s Cre rekombinázou ponecháva mutované ITIM iba v exónoch 13 a 15 a sekvenciu loxp v intróne 14/15 ako zmeny.

43 neo sonda pcd22-3bs-hindiii sonda EBEBE 1112 13 14 15 9,5 kb WT EcoRI fragment gen. Locus EB 11 kb WT BamHI fragment B zameraný na EBE tk neo B loxp loxp EB rekombinovaný lokus EE 9,5 kb rekombinovaný 3 kb rekombinovaná EB 9 kb rekombinovaná B 6 kb rekombinovaná mutácia exónu 11-15 B (stop kodón) Obr. 11: CD22 lokus divokého typu a lokus rekombinovaný s pcd22-ex12-stop s miestami štiepenia pre reštrikčné enzýmy BamHI (B) a EcoRI (E. ). Zobrazené fragmenty vznikajú po štiepení EcoRI alebo BamHI. Zmeny reštrikčných fragmentov divokého typu (WT) vznikajú v prípade rekombinácie prostredníctvom rozhraní EcoRI v neo-kazete alebo prostredníctvom rozhrania BamHI v mutagénnych priméroch.

44 a) 11kb wt/wt wt/tailless M12.2.3 M12.4.1 b) 9,5kb wt/wt wt/tailless M12.2.3 M12.4.1 9,5kb 9kb 6kb 3kb digescia: BamHI sonda: pcd22-3bs-hiii digescia: Sonda EcoRI: pcd22-3bs-hiii c) hm./Bezchv. Hm./Hm. M12.2.3 M12.4.1 9kB štiepenie: BamHI sonda: neo. Obr. 12: Southern bloty správne rekombinovaných klonov CD22-bezchybných ES buniek M12 .2.3 a M12.4.1, každý s kontrolným klonom divokého typu (hmotn./hmotn.). Schematické znázornenie lokusu divokého typu a rekombinovaného lokusu, fragmentov, ktoré sú výsledkom štiepenia EcoRI alebo bamhi, a sond, pozri obrázok 11. a) CD22-ITIM-KO Genomická DNA klonov CD22-ITIM-KO identifikovaná ako pozitívna strávený s BamHI. Výsledkom štiepenia lokusu divokého typu BamHI bol restrikčný fragment s veľkosťou 11 kb. Integrácia konštruktu pcd22-itim-ko do miesta divokého typu to zvyšuje

45 fragment na 14 kb. Ako sonda sa opäť použil Pcd22-3bs HindIII a sonda vo vnútri neo-kazety. Obrázok 13. neo-sonda sondy pcd22-3bs-hindiii-sonde BBB 1112 13 14 15 11 kb WT BamHI fragment B gen. Zamerané zameranie rekombinovaného lokusu B loxp tk poskytuje prehľad fragmentov vytvorených pri trávení BamHI a použitej sondy neo loxp BB 14 kb recomb. BamHI fragment B exón 11-15 mutoval ITIM (YF) 1 kb Obr. 13: CD22 lokus divokého typu a lokus rekombinovaný s pcd22-itim-ko s miestami štiepenia pre reštrikčný enzým BamHI (B). Zobrazené fragmenty vznikajú po štiepení BamHI. Integráciou kazety neo/tk sa rekombinovaný lokus zvyšuje o 3 kb v porovnaní s lokusom divého typu. Ako príklad ukazuje obrázok 14 Southern blot klonov CD22-ITIM-KO YFtar3F1 a YFtar10E3. Bloty ukázali, že YFtar3F1 a YFtar4E6 neobsahujú ďalšie integrácie. Pre YFtar10E3 sa však v genóme našla iná kópia konštruktu (nezobrazené).

57 pcd22-itim-ko loxp loxp 1 kb tk neo 1112 13 14 15 1) Nájdenie genómovej sekvencie 2) Vypracovanie stratégie klonovania 3) PCR klonovanie 4) Sekvenovanie 5) Delécia HSV-tk loxp loxp neo 8 9 10 1112 13 14 15 129/ola pcd22-itim-ko-ext-tk exón 8-15 mutovaných ITIM (YF) Obr. 17: Zvýšenie frekvencie homológnej rekombinácie vektora C57BL/6 pcd22-ITIM-KO v neizogénnom Pri bunkových líniách 129-ES sa vektor rozšíril o kúsok DNA z E14Tg2a amplifikovanú pomocou PCR. Predpokladom bolo nájdenie takmer úplnej sekvencie myšieho CD22 pri prehľadávaní databázy. Cieliaci experiment sa uskutočňoval v bunkovej línii ES WW6 s medzistupňom dvoch vektorov pcd22-itim-ko-ext (nezobrazené) zobrazených na obrázku (pozri text).

58 Construct Tailless (03/99) ITIM-KO (11/99) Tailless (05/00) ITIM-KO (05/00) ITIM KO (06/00) ES bunková línia Počet klonov skrínovaných pomocou PCR pozitívnej reprodukcie PCR. C57BL/6-III 300 8-4 C57BL/6-III 500 5 3 3 C57BL/6-III 200 3 2 2 C57BL/6-III 150 2 2 2 Southern Blot C57BL/6-III 400 0 - - - zmenené kultivačné podmienky: Nové médium, PBS, Pen/Strep, Gln, β-me ITIM-KO (08/00) číselník podľa PCR-Optim. Tailless (08/00) číselník podľa PCR-Optim. ITIM-KO (11/00) Bez ocasu (11/00) ITIM-KO (02/01) Bez ocasu (07/01) BALB/cI 600 0 - - - 150 1 0 - - BALB/cI 600 1 0 - - 600 7 0 - - C57BL/6-III 500 6 2 - C57BL/6-III 400 12 11 - E14Tg2a 500 2 0 - - E14Tg2a 650 2 0 - - Des. M12 2.1, 2.3, 4.1, 4.2 YFtar3F1, 4E6, 10E3 M12 8D1, 10D5 YFtar12B5, 12A4 YFtar29D2, 30F1 M12 15F5, 17B3,17B7, 17C7,18A3, 18B5,19A1, 19F2,21C4, 21E5d221 -itim-ko pcd22-itim-ko-ext-tk, použite ESGRO ITIM-KO (10/01) WW6 400 0 - - - ITIM-KO E14Tg2a 960 0 - - - Tab. 1: Prehľad všetkých experimentov so zameraním na gény tejto dizertačnej práce a získané homológne rekombinované klony

59 mesiacov/rok injektor prechodu klonom mladé párenie 05/00 M12 2,3 M12 4,1 približne P 30 približne P 30 06/00 YFtar3F1 približne P 21 09/00 M12 10D5 približne P 17 09/00 YFtar12B5 približne P 17 YFtar3F1Cre C/B2 približne P 32 B. Ledermann B. Ledermann B. Ledermann B. Ledermann žiadny - žiadny - žiadny - 2 chiméra B. Kneitz žiadny - s BL/6, bez prenosu zárodočnej línie 12/00 12/00 01/01 03/01 03/01 04/01 05/01 07/01 08/01 YFtar3F1Cre C/B4 YFtar3F1Cre C/B2 YFtar3F1Cre C/B4 YFtar3F1Cre C/B2, C/B4 YFtar3F1Cre B1 YFtar12B5 Cre S2F4, S2F4, S2F4, S2F4, S2F4, S1C8 YFtar12B5 Cre S1F7, S2F7 YFtar12B5 Cre S1A1, S3A7, S3D8 YFtar12B5 CreS3B8 cca P 32 B. Kneitz 8 chlapcov, z toho 4 chimérickí cca P 32 B. žiadny - cca P 32 Ledermann žiadny - cca P 34 B. Kneitz 2 mŕtvi, 6 mŕtvych - približne P 32 približne P 26 približne P 26 B. Kneitz B. Kneitz B. Ledermann 5 chlapcov, z toho 1 chimérický 7, 1 vysoko chimérický (zomrel) žiadny - približne P 27 B Kneitz žiadny - cca P 27 B Kneitz žiadny - cca P 28 B. Kneitz žiadny - s BL/6, bez zárodočnej línie s BL/6, bez zárodočnej línie n - tab. 2: Prehľad všetkých injekcií blastocysty uskutočnených počas tejto dizertačnej práce s homológne rekombinovanými a plne charakterizovanými klonmi buniek ES

63 vektor pcd22-itim-ko s ohľadom na prerušenú väzbu SHP-1 veľmi pravdepodobný. 149 39 35 CD22-ITIM-KO 4A1 147 53 48 CD22-ITIM-KO 6D4 140 48 35 CD22-wt Ib.D4 148 37 41 CD22-wt Vb.C3 4 6 Kontrolné IgM CD22 a2,6-sia Obr. 18: Povrchová expresia CD22 a kyseliny 2,6-sialovej na klonoch J558L-CD22-wt a J558L-CD22-ITIM-KO vybraná na skúmanie fosforylácie tyrozínu a asociácie SHP-1 CD22. Expresia povrchových markerov je znázornená ako histogram, pre každý histogram je uvedená hodnota MFI.

68 WT CD22 -/- 55,5 89,5 10,5 6,5 95,5 58,7 4,5 2,8 43 67 20,9 33 59,5 92,1 7,9 5,1 B220 + sialidáza NeuGc-SA 63,5